dicer酶对巨噬细胞功能极化的影响

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1、第三军医大学硕士学位论文Dicer酶对巨噬细胞功能极化的影响姓名：李佳申请学位级别：硕士专业：免疫学指导教师：吴玉章201205第三军医大学硕士学位论文Dicer酶对巨噬细胞功能极化的影响摘要研究目的：观察巨噬细胞在M1，M2不同功能极化状态下Dicer酶的表达情况；构建针对Dicer酶的干扰载体，建立Dicer酶表达抑制的巨噬细胞株；检测Dicer酶表达抑制巨噬细胞功能和M1、M2功能极化的改变，明确小分子RNA合成通路障碍对巨噬细胞功能极化的影响。研究方法：(1)通过RealtimePCR和Westernblot检测原代骨髓来源巨噬细胞、腹腔巨噬细胞以及巨噬细胞系RAW264．7在M1、M

2、2不同功能状态下Dicer酶的表达情况。(2．)将Dicer基因mRNA作为RNA干扰的靶区，设计特异的Dicer．siRNA干扰序列，插入含U6和H1双启动子的慢病毒载体Double-promoterpFIV．H1／U6siRNAExpressionvector中，构建成抑制Dicer基因表达的KNA干扰表达载体，并转染小鼠巨噬细胞株RAW264．7中，通过RealtimePCR和Westernblot观察干扰载体对Dicer酶表达的抑制效果；通过microRNArealtimePCR检测对mira55、mir-223的抑制效果；通过CCK8检测对细胞增殖的影响；通过凋亡试剂盒检测对细胞死亡

3、凋亡的影响；通过Transwell小室检测细胞迁移功能；通过FITC—dextran吞噬实验检测巨噬细胞的吞噬功能。(3)通过RealtimePCR和体外细胞杀菌实验检测抑制Dicer酶表达后巨噬细胞M1、M2功能状态的变化。研究结果：(1)Dicer酶在巨噬细胞M1功能状态下表达降低，耐受时表达升高；在巨噬细胞M2功能状态下表达增高。(2)成功构建Dicer-siRNA慢病毒表达载体及筛选出有效干扰Dicer酶表达的稳定巨噬细胞株；CCK8及凋亡实验显示，当Dicer酶受抑制后，细胞增殖未受影响，凋亡／死亡率有所增高；迁移实验证实Dicer酶表达受抑后细胞迁移能力没有明显改变；吞噬实验证明D

4、icer酶抑制未影响细胞的吞噬活力。(3)Dicer酶表达下调抑制了巨噬细胞向M2功能方向极化，促进巨噬细胞向M1功能方向极化，并可增强巨噬细胞的杀菌能力。结论：(1)巨噬细胞不同功能状态下Dicer酶的表达水平各异，表明Dicer表达水平在不同极化条件下受到不同调控；(2)在巨噬细胞中抑制Dicer酶表达可增加细胞死亡和凋亡，其增殖、吞噬、迁移等基本生物行为未受明显影响(3)巨噬细胞Dicer酶表达受抑制导致细胞向M2型极化减弱，向M1型极化及杀菌作用增强。关键词：MicroRNAs；Dicer；巨噬细胞：巨噬细胞极化第三军医大学硕士学位论文EffectofDicerOilmacrophag

5、epolarizationAbstractobjective：ToanalyzeDicerexpressioninmacrophageafterstimulation研t11well-establishedM1orM2polarizingagents；InhibitDicerexpressioninmacrophagebyRNAinterferencebasedonlentivirusdeliveryinvitroandobservethechangesofmacrophagepolarizationwhenDicerweredown—regulated，hopingtoidentifyDic

6、eraswhatwebelievetobearegulatorofmacrophagepolarization．Methods：(1)TodeterminewhetherDicerarecriticalinmacrophagepolarization，wefirstperformedquantitativeRTPCRandwesternblottoanalysisforDicerinmouseperitonealmacrophages(PMs)，M-CSF-differentiatedmousebonemarrow-derivedmacrophages(BMDMs)andmousemacrop

7、hagecelllineRAW264．7afterstimulationw．ithwell-establishedM1orM2polarizingagents．(2)WedesignedandconstructedsiRNAaimedDicergene，andloadedthemintopFIV-basedLentivectorExpressionSystemwhichhasbothU6andH1