昆虫杆状病毒载体

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1、昆虫杆状病毒表达系统高遄生物化学与分子生物2120422原核细胞系统大肠杆菌细胞操作简便周期短、收益大表达产物稳定相对分子质量有限不能对表达产物进行一些翻译后加工、修饰体外基因表达系统真核细胞系统哺乳动物细胞酵母细胞昆虫细胞（杆状病毒表达系统）独特特性前言高表达低成本安全性高大规模生产前言昆虫杆状病毒表达系统是目前国内外十分推崇的真核表达系统。利用杆状病毒结构基因中多角体蛋白的强启动子构建的表达载体，可使很多真核目的基因得到有效甚至高水平的表达。具有高效表达、基因克隆容量大、重组病毒易于筛选、安全性高、且有完备的翻译后加工修饰系统等特点，现已成

2、为基因工程四大表达系统之一。利用该表达系统获得重组蛋白可用于药物开发、疫苗生产、生物杀虫剂等多个领域。据文献统计，已有1000余种外源基因在昆虫杆状病毒表达系统中得到了成功地表达，其中约有95%的外源重组蛋白能够被正确的转译后加工修饰，具有与天然蛋白相同的生物活性。昆虫杆状病毒表达系统2.杆状病毒载体表达系统的特点3.昆虫杆状病毒表达系统的应用1.昆虫杆状病毒表达系统的构成4.参考文献1.昆虫杆状病毒表达系统的构成1.1杆状病毒载体1.2昆虫细胞宿主表达体系1.昆虫杆状病毒表达系统的构成表达过程将外源目的基因插入到启动子下游与杆状病毒重组，获得

3、重组病毒将重组的病毒纯化感染昆虫细胞或虫体外源基因随着病毒的复制而获得表达1.1杆状病毒载体1.1.1杆状病毒简介杆状病毒是研究细胞分子生物学的重要工具，同时也是外源基因在昆虫细胞中表达的载体。杆状病毒只来源于无脊椎动物，已发现600多种杆状病毒，其中仅有不到20种进行了分子生物学研究。杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA分子，大小为80~160kb，其基因组可在昆虫细胞核复制和转录。DNA复制后组装在杆状病毒的核衣内，后者具有较大的柔韧性，可容纳较大片段的外源DNA插入，因此是表达大片段DNA的理想载体。其中,用作外源基因表达载体的杆状病

4、毒，目前仅限于核型多角体病毒(nuclearpolyhedrosisvirus,NPV)。1.1杆状病毒载体现已知基因组全序列的杆状病毒仅有7种:苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)家蚕核多角体病毒(BmNPV)黄杉毒蛾多核衣壳核多角体病毒(OpMNPV)舞毒蛾多核衣壳核多角体病毒(LdMNPV)甜菜夜蛾多核衣壳核多角体病毒(SeMNPV)棉铃虫核型多角体病毒(HaNPV)斜纹夜蛾核型多角体病毒(SpltMNPV)1.1杆状病毒载体AcMNPV是昆虫杆状病毒表达系统中最常用的载体，基因表达分为4个阶段:立即早期基因表达、早期基因表达、晚期

5、基因表达和极晚期基因表达。早于DNA复制病毒DNA合成多角体蛋白是形成包含体的主要成分，感染后期在细胞中的积累可高达30%~50%，是病毒复制非必需成分，但对病毒粒子却有保护作用，可使之保持稳定和感染能力。P10蛋白为另一类高效表达的极晚期蛋白，也是一类病毒复制非必需成分，可在细胞中形成纤维状物质，可能与细胞溶解有关。理想的外源基因插入位点1.1杆状病毒载体载体重组原理：原理是人为将杆状病毒多角体蛋白两翼序列的同源序列引入含外源基因的质粒载体中，通过同源重组方式来实现外源基因对病毒多角体蛋白基因的替换。由于杆状病毒分子质量约为134kb，不能利

6、用多克隆位点（酶切连接）进行基因重组，只能利用杆状病毒和带有外源基因的质粒载体进行共转染（转移载体的介导）。多克隆位点：DNA载体序列上人工合成的一段序列，含有多个限制内切酶识别位点。能为外源DNA提供多种可插入的位置或插入方案。共转染：物理上不相连的基因被整合到同一整合序列并在同一转染细胞内表达的现象。1.1杆状病毒载体1.1.2杆状病毒载体的重组将极晚期基因(如多角体基因及其边界区)克隆入细菌的质粒中消除其编码区和不合适的酶切位点保留其5c端对高效表达必需的调控区在下游引入合适的酶切位点供外源基因的插入，即得到转移载体。将要表达的外源基因插

7、入其启动子下游与野生型AcNPVDNA共转染昆虫细胞通过两侧同源边界区在体内发生同源重组，使多角体蛋白基因被外源基因取代。1.1杆状病毒载体1.1.3杆状病毒载体的筛选由于多角体基因被破坏，则不能形成多角体。这种表型在进行常规空斑测定时，可同野生型具有多角体的病毒空斑区别开来，这就是最初的筛选重组病毒的方式。由于重组效率较低(0.1%~1%)，表型差别不显著，应用上有一定的困难。1.1杆状病毒载体1.1.3杆状病毒载体的筛选为此，经过不断探索，在重组杆状病毒的筛选与鉴定方面取得了很大改进。具体方法有以下几种：β-半乳糖苷酶的蓝白筛选体外酶促定位

8、重组BacmidTK基因Neo基因BacmidLuckow等开发。快速、高效产生重组AcMNPV病毒。取杆状病毒(baculovirus)和质粒(pl