核酶PAPR-1在大鼠腰5脊神经结扎引起神经病理性痛中的作用及其机制

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学校代码10459学号或申请号201512263039密级公开硕士学位论文核酶PAPR-1在大鼠腰5脊神经结扎引起神经病理性痛中的作用及其机制作者姓名：高岩导师姓名：许继田教授学科门类：理学专业名称：生理学培养院系：基础医学院完成时间：2018年5月 原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中己经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研宄作出重要贡献的个人和集体。。，均己在文中以明确方式标明本声明的法律责任由本人承担学位论文作者：曰期冷年《月２曰学位论文使用授权声明一＊。本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州、大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学一位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第署名单位仍然为郑＂州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。：月２日学位论文作者＾日期＾？ AThesisSubmittedtoZhengzhouUniversityfortheDegreeofMasterTheRoleofPAPR-1inthePathogenesisofNeuropathicPainfollowingLumbar5SpinalNerveLigationinRatsByYanGaoSupervisor:Prof.Ji-TianXuDepartmentofPhysiology&NeurobiologyCollegeofBasicMedicalSciencesZhengzhouUniversityMay,2018 核酶PARP-1在大鼠腰5脊神经结扎引起神经病理性痛中的作用及其机制研究生：高岩导师：许继田教授郑州大学基础医学院生理学与神经生物学系河南郑州450001摘要研究背景和目的神经病理性痛是最常见的慢性痛之一，主要由神经损伤或炎症引起，其显著特点为损伤愈合后疼痛症状依然存在，且痛感强烈、顽固，给患者造成了极大的痛苦，目前其确切机制仍不清楚。核蛋白聚ADP-核糖基化（Poly(ADP-ribose)ation，PAR）是聚ADP-核糖聚合酶（poly(ADP-ribose)polymerase,PARP）激活后，利用尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）提供的ADP-核糖，催化其与相关核蛋白结合，形成多聚ADP-核糖基化核蛋白,也被认为是表观遗传学的一种形式。研究发现PARP-1激活通过促进炎症相关的基因表达在炎性疾病的发生过程发挥重要作用。最近研究证明PARP-1催化的核蛋白聚ADP-核糖化通过调控基因转录参与脑学习与记忆的长时程突触可塑性。周围神经损伤或炎症诱导的脊髓水平突触传递的可塑性，被认为是病理性痛形成和维持过程中枢敏感化的基础，但迄今PARP-1在神经病理性痛中的作用及机制仍无系统的研究和报道。本实验采用大鼠腰5脊神经结扎（Lumbar5SpinalNerveLigation，L5SNL）疼痛模型，结合痛行为学实验和Westernblot、RT-PCR和qPCR等分子生物学技术，观察核酶PARP-1在L5SNL引起神经病理性痛中的作用以及PARP-1激活调控神经病理性痛的机制。其结果将为进一步阐明神经病理性痛的机制提供新的理论上的依据，同时也可能为临床病理性痛的防治提供新的药物作用靶点。I 研究结果1.大鼠L5SNL后PARP-1及其催化产物PAR、以及致炎细胞因子IL-1β和TNF-α在DRG和脊髓中的表达变化（1）L5SNL模型的建立将实验用雄性SD大鼠随机分为实验组（L5SNL组,n=10）和对照组（sham组,n=8），参照文献报道的方法进行L5SNL手术，测试术前3、1天和术后1、3、5、7、10、14、21、28天的机械刺激撤足阈值（Pawwithdrawalthreshold，PWT）和热刺激撤足潜伏期（Pawwithdrawallatency，PWL），发现从术后1天开始大鼠术侧后肢PWT和PWL开始显著下降（与sham组相比较，***P＜0.001,**P＜0.01），并且在术后第7天达到最低（与sham组相比较，***P＜0.001，***P＜0.001），而对侧无明显变化。（2）L5SNL后大鼠DRG和脊髓背角PARP-1、PAR及致炎细胞因子IL-1β和TNF-α的表达变化取术后0、1、3、7、10、14天大鼠术侧L4-5DRG和L4-5脊髓进行RT-PCR和qPCR检测PARP-1mRNA含量的变化，取对侧L4-5DRG和L4-5脊髓进行qPCR检测PARP-1mRNA含量的变化，取术侧L4-5DRG和L4-5脊髓进行Westernblot检测PARP-1及其下游产物PAR以及致炎细胞因子IL-1β、TNF-α表达量变化。RT-PCT和qPCR结果显示L5SNL可以引起术侧L4-5DRG和L4-5脊髓PARP-1mRNA含量升高，并在术后第7天或第10天达到最高（与对照组相比，*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001，n=3），而对侧qPCR结果显示PARP-1mRNA含量无明显变化。Westernblot结果显示，L5SNL后PARP-1及催化产物PAR以及致炎细胞因子IL-1β、TNF-α的表达量维持在较高水平，并且在第7天表达量最高（与对照组相比，*P＜0.05,**P＜0.01，***P＜0.001，n=3）。以上结果表明L5SNL可引起大鼠术侧L4-5DRG和L4-5脊髓中PARP-1及其催化产物PAR、以及致炎细胞因子IL-1β、TNF-α表达上调。2.大鼠L5SNL后PARP-1在DRG和脊髓背角表达的细胞类型利用免疫荧光组织化学技术对L5SNL和正常大鼠的L4-5DRG和脊髓进行染色拍照观察，发现L5SNL可以引起PARP-1在DRG和脊髓背角表达升高。进一步采用免疫荧光双染色技术对PARP-1在DRG和脊髓中表达的细胞类型进II 行了观察，结果显示，PARP-1与DRG中的大中型神经元细胞和小型神经元细胞有共定位，与脊髓中的神经元细胞和卫星样胶质细胞有共定位。3.鞘内注射PARP-1抑制剂Tiq-A能够部分抑制L5SNL引起的神经病理性痛，同时也可以下调PAR以及致炎细胞因子IL-1β、TNF-α的表达。大鼠L5SNL后立即鞘内注射PARP-1抑制剂Tiq-A（5、25、50μg/10μl）,而后每天1次，连续5天，同时观察大鼠的痛行为学变化。结果显示，与溶剂组（i.t.10μL10%DMSO生理盐水）相比较，鞘内注射Tiq-A组大鼠术侧后肢PWT和PWL呈剂量依赖性升高（1d，P＜0.001；3d,P＜0.001；5d,P＜0.001；7d,P＜0.001；10d,P＜0.001；14d,P＜0.001，n=8）。Westernblot结果显示，与L5SNL+Vehicle组相比，高剂量组（i.t.50μg/10μl）术后第7天大鼠术侧L4-5DRG和L4-5脊髓中PAR和致炎细胞因子IL-1β、TNF-α的表达量降低（*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001，n=3）。这表明了抑制PARP-1的活性可以部分抑制神经病理性痛的产生，同时也可以抑制L5SNL引起的大鼠术侧L4-5DRG和L4-5脊髓中PAR、IL-1β、TNF-α表达上调的情况。4.神经病理性痛形成后，鞘内注射PARP-1抑制剂Tiq-A能够部分逆转神经病理性痛的症状。L5SNL后第7天开始，对大鼠进行鞘内注射Tiq-A50μg/10μl每只每天，连续注射4天，观察大鼠术侧后肢PWT和PWL。结果发现从注射药物后开始，大鼠术侧后肢的PWT和PWL开始出现明显升高，并且在停药后一直持续到术后第14天（7d,P＜0.001；10d,P＜0.001；14d,P＜0.001，n=7）。说明在神经病理性痛建立之后，抑制PARP-1的活性可以部分逆转由L5SNL引起的神经病理性痛。5.鞘内注射PARP-1siRNA可以部分抑制神经病理性痛的形成。将实验大鼠随机分为sham+转染试剂（TransfectionRegant，TR）组、L5SNL+PARP-1siRNA组、L5SNL+ScramblesiRNA组、L5SNL+TR组，每组8只，术后立即注射药物，siRNA组每天每只1nmolsiRNA，转染试剂组每天每只10μl转染试剂，连续注射5天，同时观察大鼠痛行为学变化。结果显示，鞘内注射PARP-1siRNA组与L5SNL+TR组相比，大鼠术侧后肢PWT在术后3天开始III 出现明显升高（***P＜0.001）并一直持续到术后第7天（***P＜0.001）。而术侧后肢的PWL在术后1天即出现显著升高（**P＜0.01），同样一直持续到术后第7天（***P＜0.001）。ScramblesiRNA组与L5SNL+TR组相比较，没有统计学差异。Westernblot结果显示，鞘内注射PAPR-1siRNA可以使术侧L4-5DRG和L4-5脊髓中PARP-1、PAR以及致炎细胞因子IL-1β、TNF-α的表达量降低（与sham+TR组相比较，#P＜0.05，##P＜0.01，n=3）。6.运动功能检测发现给药并未对实验大鼠的运动功能造成影响。连续给药后的大鼠在完成机械刺激撤足阈值和热刺激撤足潜伏期的测试后，进行运动功能检测。通过放置反射、抓握反射、翻正反射3种测试之后，给药的大鼠均能保持3种反射的运动功能，没有运动功能异常的情况出现。结论：大鼠L5SNL后DRG和脊髓背角PARP-1的表达上调通过调控IL-1β和TNF-α的表达，参与了神经病理性痛的形成和维持。关键词：神经病理痛；PARP-1；DRG；脊髓；致炎细胞因子IV TheroleofPAPR-1inthepathogenesisofneuropathicpainfollowinglumbar5spinalnerveligationinratsMasterdegreecandidator:YanGaoSuperviser:Prof.Ji-TianXuDepartmentofPhysiology&Neurobiology,CollegeofBasicMedicalSciencesZhengzhouUniversity100ScienceAvenue,Zhengzhou450001AbstractBackgroundNeuropathicpainisoneofthemostcommonchronicpains.Neuropathicpainismainlycausedbynerveinjuryorinflammation,continuouspainsymptomsafterthewoundhealingisprominentfeatureofneuropathicpain,whichisintenseandstubbornandcausesgreatpaintothepatient.Theexactmechanismsofneuropathicpainarestillnotclear.Poly(ADP-ribose)ation(PAR)iscatalyzedbypoly(ADP-ribose)polymerase(PARP)usingnicotinamideadeninedinucleotide(NAD+)providesADP-riboseandcombinewithrelatednuclearproteinstoformpolyADP-ribosylatednuclearproteins.PARisconsideredtobeaformofepigenetics.StudiesimpliedthatactivationofPARP-1promotesinflammation-relatedgeneexpression,whichplaysanimportantroleinthedevelopmentofinflammatorydiseases.RecentstudiesdemonstratedthatnucleoproteinpolyADP-ribosylationcatalyzedbyPARP-1participatesinlong-termsynapticplasticityinbrainlearningandmemorybyregulatinggenetranscription.Theplasticityofsynaptictransmissionatthelevelofthespinalcordinducedbyperipheralnerveinjuryorinflammationisconsideredtobethebasisforthecentralsensitizationofpathologicalpainformationandmaintenance.However,therolesofPARP-1inneuropathicpainhavenotbeenfurtherstudiedandreportedsystematically.V Inthisstudy,Lumbar5SpinalNerveLigation(L5SNL)painmodel,incombinationwithpainbehaviortestsandmolecularbiologytechniquessuchasWesternblot,RT-PCR,andqPCR,wereusedtoobservethattheroleofribozymePARP-1inneuropathicpaininducedbyL5SNLandthemechanismofPARP-1activationinregulatingneuropathicpain.Theresultswillprovideanewtheoreticalbasisforfurtherelucidatingthemechanismofneuropathicpain,andmayalsoprovidenewtargetsforthetreatmentofclinicalpathologicalpain.Results1.ExpressionofPARP-1anditscatalyticproductPAR,pro-inflammatorycytokinesIL-1βandTNF-αinDRGandspinalcordafterratL5SNL.(1)EstablishmentofL5SNLmodelMaleSDratswererandomlydividedintoexperimentalgroup(L5SNLgroup,n=10)andcontrolgroup(shamgroup,n=8).L5SNLwasperformedaccordingtothemethodsreportedintheliterature.ThePawwithdrawalthreshold(PWT)andPawwithdrawallatency(PWL)weredetectedonpostoperative1,3,5,7,10,14,21and28days.After1day,PWTandPWLinthehind-limboftheratsbegantodecreasesignificantly(***P<0.001,**P<0.01comparedwiththeshamgroup)andreachedaminimumonthe7thdayafteroperation(comparedwiththeshamgroup,***P<0.001,***P<0.001),butnosignificantchangesonthecontralateralside.(2)ExpressionchangesofPARP-1,PARandIL-1βandTNF-αinratDRGandspinaldorsalhornafterL5SNLTheL4-5DRGandL4-5spinalcordswereexaminedbyRT-PCRandqPCRat0,1,3,7,10,and14daysafteroperationtodetectPARP-1mRNAlevels,andthecontralateralL4-5DRGwastaken.QPCRwasusedtodetectthechangesofPARP-1mRNAlevelsintheL4-5spinalcordexpressionifPARP-1anditsdownstreamproductPAR,proinflammatorycytokinesIL-1βandTNF–αweredetectedbyWesternblotinL4-5DRGandL4-5spinalcords.ResultsofRT-PCRandqPCRshowedthatL5SNLinducedimprovementofthePARP-1mRNAlevelinthespinalL4-5DRGandL4-5spinalcords,andreachedthehighestlevelonthe7thor10thpostoperativeday(comparedwiththecontrolgroup,*P