晚期糖化终产物受体中和抗体缓解腰5脊神经结扎大鼠神经病理性疼痛的效果观察.pdf

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海军医学杂志2015年5月第36卷第3期JournalofNavyMedicine，Vo1．36，No．3，May2015·205·．临床医学．．论著．晚期糖化终产物受体中和抗体缓解腰5脊神经结扎大鼠神经病理性疼痛的效果观察李向南，李永华，袁红斌[摘要]目的观察大鼠腰5脊神经结扎后注射晚期糖化终产物受体(RAGE)中和抗体的镇痛效果，探讨其在背根神经节发挥作用的机制。方法雄性sD大鼠，体质量200～250g，采用结扎腰5脊神经(I5)制备神经根结扎(SNL)模型。30只雄性SD大鼠按数字表法随机分为3组，每组10只。分别为药物组(SNL术后每天鞘内注射RAGE中和抗体)、对照组(假手术后+磷酸缓冲盐溶液)、安慰剂组(SNL术+磷酸缓冲盐溶液)。于术前及术后不同时点测定大鼠的机械撤爪阈值和热刺激缩爪潜伏期。取大鼠背根神经节，进行免疫荧光染色，采用ELISA检测各组中肿瘤坏死因子(TNF)．ot和白细胞介素(IL)．1口的表达。结果SNL术后，L5背根神经节RAGE平均荧光强度(42．80±4．19)比术前(19．78．4-4．19)增高，差异有统计学意义(P<0．05)。安慰剂组大鼠术后1、3、5、7d机械缩爪阈值(9．304-2．10，4．604-1．35，3．80±1．40，3．604-1．26)与对照组(13．004-2．58，12．50±2．64，13．50±2．42，13．00±2．58)比较差异有统计学意义(P<0．05)。安慰剂组大鼠术后1、3、5、7d热刺激缩爪潜伏期(10．014-1．16，5．40±1．51，4．32±1．16，4．404-1．43)与对照组(12．804-1．14，13．00±1．25，12．70±1．34，12．80±1．55)比较差异有统计学意义(P<0．05)。药物组大鼠术后3、5、7d机械缩爪阈值(8．004-2．31，7．40±2．12，7．20±1．93)与安慰剂组(4．604-13．50，3．504-1．14，3．604-1．26)比较差异有统计学意义(P<0．05)。药物组大鼠术后3、5、7d热刺激缩爪潜伏期(8．154-1．37，8．26±1．29，7．004-1．07)与安慰剂组(5．414-1．51，4．324-1．16，4．40±1．43)比较差异有统计学意义(P<0．05)。药物组大鼠术后I5背根神经节TNF—表达量(70．53±6．57)与安慰剂组(109．90±4．97)比较差异有统计学意义(P<0．05)。药物组大鼠术后L5背根神经节IL-1表达量(88．24±3．60)与安慰剂组(168．77±6．34)比较差异有统计学意义(P<0．05)。结论RAGE中和抗体通过抑制背根神经节TNF一和IL一1JB生成，缓解SNL大鼠的痛觉敏感。[关键词]神经病理性疼痛；晚期糖化终产物受体；肿瘤坏死因子oL；白细胞介素1[中图分类号]R651[文献标识码]A[DOI]10．3969／j．issn．1009—0754．2015．03．005AlleviationofallodyniaintheratmodelofspinalnerveligationbyintrathecalreceptorforadvancedglycationendproductneutralizingantibodyLiXiangnan，LiYonghua，YuanHongbin(DepartmentofAnesthesia，ChangzhengHospital，SecondMilitaryMedicalUniversity，200003Shanghai，China)[Abstract]ObjecfiveToobservetheeffectofreceptorforadvancedglycationendproducts(RAGE)neutralizingantibodyinjectiononneuropathicpainandtheexpressionofTNF—otandinterleukin一1Binthedorsalrootganglion(DRG)．MethodsTheSNLmodelwasdevelopedbyusingadultmaleSprague—Dawleyratswithabodymassof200—250g．Thirtyanimalswererandomlydividedinto3groups：thedruggroup，thecontrolgroupandtheplacebogroup，eachconsistingof10animals．Thedruggroupwasinjectedwithanti—RAGEintrathecally，afterdevelopmentoftheSNLmode1．Thecontrolgroupwasinfusedwithphosphatebufferedsaline(PBS)af-tershamsurgery．AndtheplacebogroupwasinfusedwithPBSafterSNLsurgery．Pawwithdrawalthresholds(PWT)andpawthermalwithdrawlatency(唧L)ofeachgroupweredetectedatdifferenttimepointsbothbeforeandaftersurgery．Thedorsalrootganglions[基金项目]国家自然科学基金项目(81871054)；上海市教育委员会科研创新项目(14ZZ083)[作者单位]200003上海，第二军医大学附属长征医院麻醉科 ·206·海军医学杂志2015年5月第36卷第3期JournalofNavyMedicine，Vo1．36，No．3，May2015werecollectedforimmunohistochemistryanddeterminationoftheexpressionlevelsofTNF—oLandinterleukin一1Binthe3groups．ResultsTheexpressionlevelofRAGEinL5DRGwasincreasedafterSNLsurgery，ascomparedwiththatbeforesurgery(42．80±4．19ver—sus19．78±4．19)(P<0．05)．Whencomparedwiththoseofthecontrolgroup，thereweresignificantreductionsinPwT(9．30±2．10versus13．O0±2．58，4．604-1．35versus12．50±2．64，3．80±1．40versus13．50±2．42，3．60±1．26versus13．00±258)andinPrwL(1O．Ol±1．16versus12．80±1．14，5．40+1．51versus13．00±1．25，4．32±1．16versus12．7±1．34，4．40±1．43versus12．80±1．55)fortheplacebogroupatdays1，3，5and7(P<0．05)．Whencomparedwiththoseoftheplacebogroup，significantelevationscouldbeseeninPWT(8．O0±2．31versus4．60±13．50，7．40±2．12versus3．50±1．14，7．20±1．93versus3．604-1．26)andinP。(8．15±1．37versus5．41±1．51，8．26±1．29versus4．32士1．16，7．O0±1．07VerSus4．40±1．43)atdays3，5and7forthedruggroup(尸<0．05)．TheexpressionlevelsofTNF-oL(70．53±6．57versus109．90±4．97)andIL一1／3(88．24±3．60versus168．77±6．34)werealldecreased，ascomparedwiththoseoftheplacebogroupafterSNLsurgery(P<0．05)．ConclusionRAGEneutralizingantibodycouldbeformedthroughtheexpressionsofTNF一0【andIL一113．thusalleviatingallodyniainratswithSNLsurgery．[Keywords]Neuropathicpain；Receptorforadvancedglyeationendproduct；Tumornecrosisfactor-；Interleukin一1神经病理性疼痛是一种常见的难治性疼痛，指1．2方法原发或继发于神经系统损害、功能障碍所导致的疼1．2．1鞘内置管于大鼠腹腔注射戊巴比妥钠20痛。创伤、手术、糖尿病及感染常导致神经病理性疼mg／kg，消毒后，沿脊椎中线切开皮肤，找到L5、L6痛的发生，而临床上有效的治疗办法并不多。卫星棘突根部缝隙，用小针刺破，将PE一10导管内充满生胶质细胞(satelliteglialcells，SGCs)作为背根神经理盐水后，从缝隙中插入髓鞘内约1．5cln。导管从节(DRG)中围绕感觉神经元的胶质细胞，其神经免皮下沿脊柱向上在大鼠颈部穿出固定，封闭导管，消疫功能受到疼痛学研究的普遍重视。目前认为，外毒分层缝合肌肉及皮肤。以大鼠鞘内注射10l利周神经损伤后，激活的卫星胶质细胞介导启动了一多卡因后后脚明显出现瘫软，30min内恢复反应作系列免疫炎症反应，分泌包括肿瘤坏死因子(TNF-为手术成功的标准。置管成功后单笼饲养。)在内的一系列促炎细胞因子，介导感觉神经元的1．2．2动物模型建立将置管成功的大鼠，参考痛觉过敏J。晚期糖化终产物受体(recepotrforad—Kim等。。方法建立大鼠腰5神经根结扎(SNL)模vancedglycationendproducts，RAGE)，是一种细胞型。大鼠麻醉后，于大鼠L4～s2棘突水平沿背部膜表面免疫球蛋白超家族蛋白受体，广泛分布，其下皮肤作纵向中线切口，分离肌肉至第5腰椎横突，切游NFKB人核调节炎症因子的释放。本研究旨断横突暴露第5腰神经，用5-0丝线结扎神经，缝合在观察抑制炎症因子的上游RAGE中和抗体是否对皮肤与肌肉，避免术后感染。对照组仅暴露但不结腰5脊神经结扎大鼠神经病理性疼痛的缓解有更好扎L5神经，其余步骤相同。的效果，现报道如下。1．2．3免疫组化荧光染色采用数字表法随机选1材料与方法取正常大鼠和SNL后大鼠各4只麻醉后灌流固定，1．1实验动物和分组雄性SD大鼠，体质量200取术侧L5和L4背根神经节，放入4％PFA固定4～250g，由第二军医大学实验动物中心提供，动物6h，然后用20％蔗~／PBS溶液脱水2d。将组织包合格证号：SCXK(沪)2007-0003。筛选基础痛阈值埋15m切片，贴片在92．5℃的水浴抗原修复10在10～18g之问的大鼠，分为3组：(1)对照组10rain。0．01mol／LPBS漂洗3次，每次5rain。贴片只，暴露左侧I5脊神经，但不结扎，注射生理盐水。滴加羊抗RAGE多克隆一抗(1：100)，室温孵育l6(2)安慰剂组10只，暴露左侧L5脊神经并结扎，术—18h，0．O1mol／LPBS漂洗3次，每次5min，然后后鞘内注射生理盐水。(3)药物组1O只，暴露左侧加Cy3．驴抗羊IgG二抗(1：400)，0．Olmol／LPBS漂脊神经并结扎，手术后鞘内注射RAGE中和抗体洗3次，每次5rain，加甘油分封片。在荧光显微镜5g／d，至术后第7天。各实验组大鼠采用低剂量下观察并拍照(×400)。(约l01)缓慢注射(3．3min)的方法以保证注1．2．4测定机械缩爪阈值和热刺激缩爪潜伏期射药物扩散在大鼠腰5脊神经。实验中SD大鼠在分别于手术前1d、手术后第1、3、5、7天测定大鼠机标准条件下饲养，自由摄取水和食物，手术前6h禁械缩爪阈值(pawwithdrawlthreshold，PwT)和热刺食禁饮。激缩爪潜伏期(pawthermalwithdrawlatency，PT— ·208·海军医学杂志2015年5月第36卷第3期JournalofNavyMedicine．Vo1．36．No．3．May2015．_．卜对照组150^山)餍《好警_．罨．-安慰剂A组O100．：{：}ab：i：{工b星5o：}O童l对照组安慰剂组药物组Al35200a时间(d)^1502普一上100娶lH：蓬—a—b5O委錾I／宙l羹0B注：与对照组比较P<0．05；与安慰剂组比较P<0．05；A为Bl35TNF—a表达情况，B为IL一1口的表达情况；TNF—a为肿瘤坏死因子，时间(d)IL一1口为白细胞介素1图3各组大鼠背根神经节中TNF一和IL·的表达情况注：与对照组比较P(0．05；与安慰剂组比较P<0．05；A为大鼠机械缩爪阈值结果，B为大鼠热刺激缩爪潜伏期结果绕感觉神经元构成了一个感觉神经元的微环境，一图2各组大鼠不同时间点机械缩爪阈值与热刺激缩爪潜伏期方面调节神经元的功能，另一方面其稳定性也受神大鼠术后L5背根神经节IL一1表达量(88．24±经元的影响。笔者的研究发现RAGE在IJ5脊神经3．60)与安慰剂组(168．77±6．34)比较差异有统计结扎后的DRG组织中表达增加，印证了Shibasaki等学意义(P<0．05)。见图3。研究结果，根据其研究报道，RAGE在SNL模型建立3讨论后脊髓背角的表达没有显著差异。RAGE作为细胞膜表面免疫球蛋白超家族蛋白外周神经损伤后，卫星胶质细胞的功能和状态受体，具有多种配体，包括HMGB1S100／钙结合蛋发生改变。激活的卫星胶质细胞增殖并启动了一系白、淀粉样多肽J。在生理状态下呈低水平表达，当列免疫炎症反应，介导DRG感觉神经元的痛觉过细胞处于激活或应激状态时，受损细胞中RAGE的敏，在这个过程中释放大量的促炎症因子。以往的表达增多。RAGE与配体结合后激活细胞内各种信研究中发现，肿瘤坏死因子仅是神经系统较早释放号转导机制，其中最重要的是氧化应激反应的增加的促炎细胞因子之一，其受体TNFR在毗邻损伤的和免疫炎性反应的加剧，最终产生致病效应。RAGE外周神经元上表达上调J，提示TNF一仅可能在神经与不同配体结合后，可以激活细胞内不同的信号传病理性疼痛的形成和发展中发挥重要的作用。炎症导通路，比如Ras．ERK、p38一MAPK和cdc42／rac途因子一方面作用于神经元，通过胶质神经元交互作径，其多种信号通路大部分可通过NF—KB调节基因用改变神经元的敏感性，另一方面又可自分泌作用转录。NF-KB的激活可引起靶细胞产生大量的促炎于SGCs，形成正反馈，使pERK水平长时间增高，进因子，加剧炎症反应J。而外周神经组织损伤后，作一步增加其下游NF．KB表达人核促炎因子的释放，为外周传人中枢信号换元的重要结构，背根神经节加剧疼痛状态的维持等J。虽然干预TNF—的信的功能异常对痛觉异常和痛觉过敏具有关键作用。号通路可以改善外周神经损伤导致的痛觉过敏，但卫星胶质细胞围绕感觉神经元，由缝隙连接相连，包(下转第212页) ·212·海军医学杂志2015年5月第36卷第3期JournalofNavyMedicine，Vo1．36．No．3，May2015为进一步探讨TLR4在巨噬细胞极性转化中的作nol，2011，11(11)：750-761．[5]Hasegawa—MorlyamaM，KurimotoT，NakamaM，eta1．Pernxisome用，本研究利用TLR4阻滞剂CLI-095进行干预处理proliferator·-activatedreceptor-gammaagonistrosiglitazoneattenu·-后与M1型巨噬细胞组比较，结果显示干预后TLR4atesinflammatorypainthroughtheinductionofheineoxygenase一1mRNA表达明显降低，提示TLR4的表达受到明显抑inmacrophages[J]．Pain，2013，154(8)：1402—1412．制，而处理后巨噬细胞的CD206和IL—l0明显升高，【6]LiuC，LiY，YuJ，eta1．TargetingtheshiftfromM1toM2mac—CD16／32和IL一12明显下调，符合M2型巨噬细胞的rophagesinexperimentalautoimmuneencephalomy·-elitismicetrea·特性，提示TLR4在巨噬细胞极性转化中可能具有tedwithfasudil[J]．PLoSOne，2013，8(2)：e54841．[7]ShiH，KokoevaMV，InouyeK，eta1．TLR4linksinnateimmuni-重要的作用，抑制TLR4表达有促使巨噬细胞向M2tyandfattyacid-inducedinsulinresistance[J]．JClinInvest，型极化的可能。2006，116(11)：3015-3025．本研究从细胞水平研究巨噬细胞极性转化与[8JCoenenKR，GreenML，Lee—YoungRS，eta1．Impactofmacro—TLR4的相关性，初步显示TLR4在巨噬细胞极性转phageToll—likereceptor4deficiencyonmacrophageinfiltrationinto化中具有重要作用，抑制TLR4表达具有促进巨噬adiposetissueandthearterywallinmice[J]．Diabetologia，2009，52(2)：318-328．细胞向抗炎性M2型极化的可能。[9]OrrJS，PuglisiMJ，EllaconKL，eta1．Toll—likereceptor4deft—ciencypromotesthealternativeactivationofadiposetissuemacro-[参考文献]phages[J]．Diabetes，2012，61(11)：2718-2727．SicaA，MantovaniA．Maerophageplasticityandpolarization：in[1O]翟振丽，马维红，李全忠，等．载脂蛋白A1诱导骨髓源性巨噬vivoveritas[J]．JClinInvest，2012，122(3)：787-795．细胞向抗炎性M2型极化的作用[J]．中国动脉硬化杂志，[2]GuptaH，DaiL，DattaG，eta1．Inhibitionoflipopolysac—charide—2013，21(1O)：865-870．inducedinflammatoryresponsesbyanapolipoproteinA1mimetic[11]李全忠，翟振丽，马维红，等．载脂蛋白A1改变炎症性巨噬细peptide[J]．CircRes，2005，97(3)：236-243．胞极性及其机理研究[J]．中华心血管病杂志，2014，42(2)：[3]Khallou—LaschetJ，VarthamanA，FornasaG，eta1．Macrophagc132．135．plasticityinexperimentalatherosclerosis[J]．PLoSOne，2010，5(收稿Ft期：2014一O8—25)(1)：e8852．(本文编辑：林永丽)[4]LawrenceT，NatoliG，Transcriptionalregulationofmacro—phagepolarization：enablingdiversitywithidentity[J]．NatRevImmu．◆i●iIrl◆flit●●◆◆131◆●●●●●●(上接第208页)临床上通过干预炎症因子的方法治疗疼痛存在治疗[3]SchafersM，SorkinLS，GetsC，eta1．Spinalnerveligationin—ducestransientupregulationoftumornecrosisfactorreceptorsland时间窗短，疗效差等问题J。笔者的研究将炎症因2ininjuredandadjacentuninjureddorsalrootgangliaintherat子的上游调节蛋白RAGE作为靶点，采用鞘内给予[J]．NeurosciLett，2003，347(3)：179-182．RAGE中和抗体而阻断RAGE信号传导能够扭转周[4]HessA，AxmannR，RechJ，eta1．BlockadeofTNF—rapidlyin—围神经损伤后导致的痛觉过敏，可能是通过抑制卫hibitspainresponsesinthecentralnervoussystem[J]．PNAS，星胶质细胞的活化减少了TNF-0【和IL一1生成。2011，108(9)：3731-3736．[5]ShibasakiM，SasakiM，MiuraM，eta1．Inductionofhighmobility综亡所述，外周神经损伤可引起RAGE在背根神经groupbox一1indorsalrootganglioneontributestopainhypersensitivi-节的表达增高，而鞘内注射RAGE中和抗体，可以减少tyafterperipheralnerveinjm'y[J]．Pain，2010，149(3)：514-521．TNF．仅和Il广的表达并目改善SNL后大鼠痛阈值。鉴[6]DoyaH，OhtoriS，TakahashiK，eta1．Extracellularsignal—regula—于RAGE对神经病理性疼痛发挥的作用，干预其信号通tedkinasemitogen—activatedproteinkinaseactivationinthedorsal路传导对治疗神经病理陛枣痛的具有良好的前景。rootganglion(DRG)andspinalcordafterDRGinjuryinrats[J]．Spine，2005，30(20)：2252-2256．[参考文献][7]KimSH，ChungJM．Anexperimentalmodelforperipheralneurop·athyproducedbysegmentalspinalnerveligationintherat[J]．JasminL，VitJP，BhargavaA，eta1．Cansatelliteghalcellsbethem-Pain，1992，50(3)：355-363．peutictargetsforpaincontrol[J]．NeuronGliaBiol，2010，6(1)：63-71．(收稿日期：2015—0l一06)[2]XieJ，MrndezJD，MrndezValenzuelaV，eta1．CellulSignalof(本文编辑：张阵阵)thereceptorforadvancedglycationendproducts(RAGE)[J]．CellularSignalling。2013，25(11)：2185-2197．