Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白的免疫原性及其相互作用宿主蛋白的初步研究

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学校代码：10264研究生学号：M130104155上海海洋大学硕士学位论文II型草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白的免疫原性及论文题目：其相互作用宿主蛋白的初步研究Immunogenicityofoutercapsidproteinsand英文题目：screeningofpotentialhostproteinsinteractingwiththeseproteinsinTypeIIGCRV专业：临床兽医学研究方向：水产动物病原学姓名：宗乾坤指导教师：吕利群教授二零一六年四月六日 上海海洋大学硕士论文上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日 上海海洋大学硕士论文上海海洋大学硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注中国水产科学院东海水庄平研究员主席产研究所张奇亚中国科学院水生生物所研究员委员李家乐上海海洋大学教授委员杨先乐上海海洋大学教授委员上海海洋大学国家水生答辩地点答辩日期2016.5.21动物病原库101 上海海洋大学硕士论文摘要草鱼呼肠孤病毒属于水生呼肠孤病毒属，是危害草鱼最严重的病毒性病原，其中II型GCRV为当前我国流行最广的毒株。II型GCRV包含11条dsRNA，其中S6编码的VP4、S11编码的VP35以及S7编码的VP56蛋白据推测为病毒的外衣壳蛋白，其在病毒进入细胞过程中起着重要作用并且能够诱导宿主产生适应性免疫，对其开展研究有助于了解II型GCRV的致病机制以及建立免疫学检测方法。本实验对II型GCRV外衣壳蛋白基因进行了克隆，并对蛋白进行了表达纯化及多克隆抗体制备，分析了外衣壳蛋白的免疫原性，并用酵母双杂交系统鉴定了与其作用的潜在宿主蛋白，本研究包含了以下四个方面：1.II型GCRV外衣壳蛋白基因S6的原核表达，多克隆抗体的制备，免疫原性及其相互作用宿主蛋白分析试验根据HZ08株S6基因序列，设计构建pGEX-4t-3-S6和pGBKT7-VP4重组质粒的引物，提取感染了GCRVJX02毒株的CIK总RNA，采用RT-PCR技术扩增获得约1954bp的S6目的片段。将基因S6克隆到pGEX-4t-3载体中，并转化入EscherichiacoliBL21（DE3）中。SDS-PAGE检测诱导的菌株，获得约98kDa的重组蛋白VP4（rVP4）且主要以包涵体形式存在。rVP4经尿素纯化后免疫小5鼠，获得抗rVP4多抗血清，用ELISA方法测得血清效价约为1:4×10；Westernblot结果表明，多抗血清既能识别原核表达的rVP4，也能识别JX02毒株上的VP4蛋白，并且发现感染JX02的草鱼血清中存在结合rVP4的相应抗体。证明pGBKT7-VP4诱饵质粒在酵母中无自激活作用后，用VP4作诱饵采用酵母双杂交技术从CIK文库中筛选确定4个和VP4作用的CIK蛋白。本研究获得的抗VP4多抗血清具有良好的生物学特性并且初步确定了和VP4作用的潜在宿主蛋白，rVP4作为相应抗体捕获原可以用于通过检测抗病毒抗体来确诊草鱼是否感染II型GCRV。本研究将为GCRV主要流行株免疫学检测方法的建立以及深入探讨VP4在II型GCRV入侵宿主时的生物学功能提供了基础资料。2.II型GCRV外衣壳蛋白基因S11的原核表达，多克隆抗体的制备，免疫原性及其相互作用宿主蛋白分析试验根据HZ08株的S11基因序列，设计构建pGEX-4t-3-S11和pGBKT7-VP35质粒的引物，克隆获得933bp的S11片段。原核诱导获得61kDa的重组蛋白VP35（rVP35）且以包涵体形式存在。用纯化的rVP35免疫小鼠获得抗rVP35多抗血6清，血清效价达到1:10；Westernblot表明，多抗血清既能识别原核表达的rVP35，也能识别JX02毒株上的VP35蛋白，且感染JX02的草鱼血清中存在结合rVP35I 上海海洋大学硕士论文的抗体。证明诱饵质粒pGBKT7-VP35在酵母中无自激活性后，用VP35作诱饵采用酵母双杂交技术从CIK文库中筛选得到16个和VP35作用的CIK蛋白。本研究制备了抗II型GCRVVP35的多抗血清并且初步确定了和VP35作用的宿主各蛋白，为GCRV主要流行株免疫学检测方法的建立以及深入探讨II型GCRVVP35蛋白的生物学功能提供了基础。3.II型GCRV外衣壳蛋白基因S7的原核表达，多克隆抗体的制备及其相互作用宿主蛋白分析试验根据HZ08株的S7基因序列，设计构建pGEX-4t-3-S7和pGBKT7-VP56质粒的引物，提取携带GCRVJX02W毒株的患病草鱼组织总RNA，利用RT-PCR技术扩增获得1539bp的S7片段。原核表达获得83kDa的重组蛋白VP56（rVP56）且以包涵体形式存在。用纯化的rVP56免疫小鼠获得抗rVP56多抗血清，效价6达到1:10；Westernblot表明，多抗血清可以识别rVP56。构建pGADT7-GcJAM-A和pGBKT7-VP56质粒，在酵母中证明pGBKT7-VP56无自激活性后，用VP56作诱饵从CIK文库中筛选获得8个和其作用的CIK蛋白；且发现VP56与GcJAM-A蛋白在酵母中并无相互作用关系。本研究制备了抗II型GCRVVP56蛋白的多抗血清并且初步确定了和VP56作用的CIK蛋白，为深入探讨VP56蛋白的生物学功能提供了可能。4.II型GCRV中VP56缺失株的鉴定与分析根据HZ08株的基因组序列，设计引物并扩增JX02株S1~S9基因ORF，扩增产物测序并将序列上传GeneBank。分别利用PCR技术和抗VP56多抗血清鉴定JX02S7片段的缺失情况。经测序比对发现，JX02株负责编码VP56蛋白的S7ORF存在着431bp的缺失片段，而其它基因序列和HZ08株同源性高达99%，同时JX02W株S7序列是完整的。Westernblot结果揭示，JX02病毒粒子上并不存在VP56蛋白。本研究揭示了II型GCRV中存在VP56缺失株，这为II型GCRV的深入了解提供了资料。关键词：II型GCRV，外衣壳蛋白，多克隆抗体，免疫原性，酵母双杂交II 上海海洋大学硕士论文ABSTRACTGrasscarpreovirus(GCRV),thetypestrainofAquareovirusC,isthemostimportantpathogenofgrasscarphemorrhagicdisease.AmongthethreegenotypesofGCRV,TypeIIGCRVaccountsforthemajorpandemicofgrasscarphemorrhagicdiseaseatpresentinChina.Theviralgenomeiscomposedof11segmentsofdoublestranded(ds)RNA,andbioinformaticanalysispredictedthatVP4,VP35andVP56ofTypeIIGCRVmightfunctionastheoutercapsidproteinsofreoviruses.Inthisstudy,theoutercapsidproteinsofTypeIIGCRV,genescloningoftheseproteinsandexpression,purificationandantibodiespreparation,andanalysisoftheimmunogenicityoftheseproteins,screeningofpotentialhostproteinsinteractingwiththeseproteinsbyYeasttwo-hybridsystem,Themaincontentsareasfollows:1.Expression,antibodypreparation,immunogenicityofoutercapsidproteingeneS6,andscreeningofhostproteinsinteractingwithVP4inTypeIIGCRVAccordingtothecompletesegment6sequenceofTypeIIGCRVHZ08publishedonGeneBank,twopairsofprimersforcloningrecombinantplasmidspGEX-4t-3-S6andpGBKT7-VP4weredesignedrespectively.TotalRNAs,whichwereextractedfromCIKinfectedwithGCRVJX02,wereusedasthetemplateforamplifyingtheoutercapsidproteingeneS6byRT-PCR,theamplifiedproductwasabout1954bp.GeneS6wereclonedintopGEX-4t-3expressionvector,andtransformedintoEscherichiacoliBL21forproteinexpression.AfterinductionwithIPTGandSDS-PAGEanalysis,recombinantVP4protein(rVP4)ofabout98kDainmoleculeweightwasproducedinE.coliandmainlyexistedintheformofinclusionbodies.Polyclonalantibodywasgeneratedbyimmunizationofmiceswiththe5purifiedrVP4,thetiterofwhichwasupto1:4×10.TheresultsofWesternblotshowedthatantibodywasabletoidentifybothrVP4andVP4invirusparticles.Furthermore,serumantibodiesofgrasscarpinfectedbyJX02wereabletorecognizerVP4specifically.GeneS6wasusedtogeneratethebaitplasmidpGBKT7-VP4whichwasprovedtohavenoself-activationinyeast,subsequently,cDNAlibraryplasmidofCIKcellswasscreenedinyeastAH109transformedwithpGBKT7-VP4,4positivecloneswereobtainedandanalyzedbyplasmidsequencingandnucleotidesequenceblasting.4potentialCIKproteinsweresuggestedtoholdthepotentialtobindVP4.Inthispaper,thepolyclonalantibodyagainstVP4wassuccessfullyIII 上海海洋大学硕士论文prepared,thisstudyalsoscreenedpotentialhostproteinsinteractingwithVP4,whichlaidafoundationofdevelopingaserologicaldiagnosticmethodformajorepidemicstrainsofGCRVandfunctionalstudiesofVP4.2.Expression,antibodypreparation,immunogenicityofoutercapsidproteingeneS11,andscreeningofpotentialhostproteinsinteractingwithVP35inTypeIIGCRVAccordingtothecompletesegment11sequenceofHZ08strain,twopairsofprimersforcloningrecombinantplasmidspGEX-4t-3-S11andpGBKT7-VP35weredesignedrespectively,theamplifiedproductwaswasabout933bp.pGEX-4t-3-S11plasmidwastransformedintoEscherichiacoliBL21forproteinexpression.AfterinductionwithIPTGandSDS-PAGEanalysis,rVP35wasabout61kDainmoleculeweightandmainlyexistedintheformofinclusionbodies.PolyclonalantibodywasgeneratedbyimmunizationofmiceswiththepurifiedrVP35,Thetiterofwhichwas6upto1:10.TheresultsofWesternblotshowedthatantibodywasabletoidentifybothrVP35andVP35invirusparticles.Furthermore,serumantibodiesofgrasscarpinfectedbyJX02wereabletorecognizerVP35specifically.ThebaitplasmidpGBKT7-VP35wasprovedtohavenoself-activationinyeast,subsequently,cDNAlibraryplasmidofCIKcellswasscreenedinyeastAH109transformedwithpGBKT7-VP35,16potentialCIKproteinsweresuggestedtoholdthepotentialtobindVP35.Inthispaper,thepolyclonalantibodyagainstVP35wassuccessfullyprepared,ThisstudyalsoscreenedpotentialhostproteinsinteractingwithVP35,whichlaidafoundationofdevelopingaserologicaldiagnosticmethodformajorepidemicstrainsofGCRVandfunctionalstudiesofVP35.3.Expression,antibodypreparationofoutercapsidproteingeneS7,andscreeningofpotentialhostproteinsinteractingwithVP56inTypeIIGCRVAccordingtothecompletesegment7sequenceofHZ08strain,twopairsofprimersforcloningrecombinantplasmidspGEX-4t-3-S7andpGBKT7-VP56weredesignedrespectively.TotalRNAs,whichwereextractedfromtissuesingrasscarpcarryingGCRVJX02W,wereusedasthetemplateforamplifyinggeneS7byRT-PCR,theamplifiedproductwasabout1539bp.ThepGEX-4t-3-S7plasmidwastransformedintoEscherichiacoliBL21forproteinexpression.AfterinductionwithIPTGandSDS-PAGEanalysis,rVP56wasabout83kDainmoleculeweightandmainlyexistedintheformofinclusionbodies.Polyclonalantibodywasgeneratedbyimmunization6ofmiceswiththepurifiedrVP56,thetiterofwhichwasupto1:10.TheresultsofIV 上海海洋大学硕士论文WesternblotshowedthatantibodywasabletoidentifyrVP56.ThebaitplasmidpGBKT7-VP56wasprovedtohavenoself-activationinyeast,pGADT7-GcJAM-AvectorwasconstructedforthesakeoffurthervalidationofitsinteractionwithVP56.Subsequently,cDNAlibraryplasmidofCIKcellswasscreenedinyeastAH109transformedwithpGBKT7-VP56,8potentialCIKproteinsweresuggestedtoholdthepotentialtobindVP56,nointeractionbetweenVP56andGcJAM-Aproteinwasdetectedinyeastcell.Inthispaper,thepolyclonalantibodyagainstVP56wassuccessfullyprepared,thisstudyalsoscreenedpotentialhostproteinsinteractingwithVP56.TheseresultsshouldpavethewayforfurtherfunctionalanalysisonVP56proteinformajorepidemicstrainsofGCRV.4.IdentificationandanalysisofVP56deficientstrainsinTypeIIGCRVSpecificprimerpairsweredesignedtotargeteachJX02ORFbasedontheHZ08genomesequence.Allgenomicfragmentswereamplifiedandsequencedsuccessfully,thesequencesweredepositedintheGenBankdatabase.ThedeletionintheS7genomicfragmentwasidentifiedinJX02byusingpolyclonalantibodyagainstVP56andPCR.Unlikethewell-characterizedHZ08strain,GCRVJX02hasa431bpdeletionintheS7genomicfragment,theother10genomicsegmentssharedbetweenGCRVJX02andGCRVHZ08exhibitover99%sequenceidentity,whilethedeletionwasnotexsitedinJX02Wstrain.TheresultsofWesternblotshowedthatVP56proteinwasnotexsitedinJX02virusparticles.ThisstudyrevealsthepresenceofTypeIIGCRVVP56deficientstrains,thedeletioninGCRVJX02indicatesthatVP56maynotbeessentialforviralreplication,whichlaidthefoundationforfurtherstudyofTypeIIGCRV.KEYWORDS:TypeIIGCRV,outercapsidprotein,polyclonalantibody,immunogenicity,Yeasttwo-hybridsystem.V 上海海洋大学硕士论文目录摘要...............................................................IABSTRACT..........................................................III引言...............................................................11.我国草鱼养殖概况..........................................................................................12.草鱼呼肠孤病毒..............................................................................................12.1草鱼呼肠孤病毒的发现...........................................................................22.2草鱼呼肠孤病毒的形态结构及理化特性...............................................22.3草鱼呼肠孤病毒感染的组织嗜性和病理变化.......................................32.4草鱼呼肠孤病毒编码蛋白的免疫原性...................................................42.5草鱼呼肠孤病毒的检测方法..................................................................42.6草鱼呼肠孤病毒的防治措施...................................................................53.本文研究的目的及意义..................................................................................6第一章II型GCRV外衣壳蛋白基因S6的原核表达,多克隆抗体的制备,免疫原性及其相互作用宿主蛋白分析试验....................................71.材料与方法......................................................................................................71.1主要仪器设备...........................................................................................71.2试验病毒及细胞.......................................................................................71.3试验试剂及药品.......................................................................................81.4所用软件...................................................................................................81.5目的基因的克隆.......................................................................................81.5.1总RNA的提取及cDNA第1条链的合成..........................................81.5.2引物设计及目的基因的扩增..............................................................91.6重组表达质粒的构建、表达及纯化.....................................................101.6.1VP4原核表达质粒及诱饵质粒的构建..............................................101.6.2诱导表达及可溶性分析......................................................................101.6.3目的蛋白纯化......................................................................................111.7多克隆抗体的制备和鉴定.....................................................................111.7.1多克隆抗体的制备..............................................................................111.7.2血清抗体特异性分析..........................................................................111.8基于rVP4的病毒诱导抗体的免疫学检测..........................................111.9酵母双杂交筛选与VP4可能相互作用的宿主蛋白...........................121.9.1诱饵重组质粒和文库质粒转染酵母菌AH109..................................121.9.2pGBKT7-VP4自激活检测..................................................................121.9.3营养缺陷培养基筛选阳性菌落...........................................................121.9.4质粒pGADT7插入片段.....................................................................132.结果................................................................................................................132.1S6目的基因的扩增.................................................................................132.2重组质粒的构建.....................................................................................132.3重组蛋白rVP4的诱导表达及可溶性分析..........................................142.4rVP4表达条件的优化及纯化................................................................142.5多克隆抗体的制备及其特异性分析.....................................................152.6基于rVP4的病毒诱导抗体的免疫学检测..........................................16VI 上海海洋大学硕士论文2.7诱饵重组质粒pGBKT7-VP4自激活检测............................................162.8营养缺陷培养基筛选阳性菌落..............................................................162.9阳性菌落中质粒pGADT7插入片段测序结果分析............................173.讨论................................................................................................................17第二章II型GCRV外衣壳蛋白基因S11的原核表达,多克隆抗体的制备,免疫原性及其相互作用宿主蛋白分析试验...................................191.材料与方法....................................................................................................191.1主要仪器设备.........................................................................................191.2试验病毒及细胞.....................................................................................191.3试验试剂及药品.....................................................................................191.4所用软件.................................................................................................191.5目的基因的克隆.....................................................................................191.5.1总RNA的提取及cDNA第1条链的合成........................................191.5.2引物设计及目的基因的扩增..............................................................191.6重组表达质粒的构建、表达及纯化.....................................................201.6.1VP35原核表达质粒及诱饵质粒的构建...........................................201.6.2诱导表达及可溶性分析......................................................................201.6.3目的蛋白纯化......................................................................................201.7多克隆抗体的制备和鉴定.....................................................................201.7.1多克隆抗体的制备..............................................................................201.7.2血清抗体特异性分析..........................................................................201.8基于rVP35的病毒诱导抗体的免疫学检测........................................211.9酵母双杂交筛选与VP35可能相互作用的宿主蛋白.........................211.9.1诱饵重组质粒和文库质粒转化酵母菌AH109..................................211.9.2pGBKT7-VP35自激活检测................................................................211.9.3营养缺陷培养基筛选阳性菌落...........................................................211.9.4质粒pGADT7插入片段.....................................................................212.结果................................................................................................................212.1S11目的基因的扩增...............................................................................212.2重组质粒的构建.....................................................................................222.3重组蛋白rVP35的诱导表达及可溶性分析........................................222.4rVP35表达条件的优化及纯化..............................................................232.5多克隆抗体的制备及其特异性分析.....................................................242.6基于rVP35的病毒诱导抗体的免疫学检测........................................242.7诱饵重组质粒pGBKT7-VP35自激活检测..........................................242.8营养缺陷培养基筛选阳性菌落..............................................................252.9阳性菌落中质粒pGADT7插入片段测序结果分析............................252.讨论................................................................................................................26第三章II型GCRV外衣壳蛋白基因S7的原核表达,多克隆抗体的制备及其相互作用宿主蛋白分析试验...........................................281.材料与方法....................................................................................................281.1主要仪器设备.........................................................................................281.2试验病毒及细胞.....................................................................................281.3试验试剂及药品.....................................................................................28VII 上海海洋大学硕士论文1.4所用软件.................................................................................................281.5目的基因的克隆.....................................................................................281.5.1总RNA的提取及cDNA第1条链的合成........................................281.5.2引物设计及目的基因的扩增..............................................................291.6重组表达质粒的构建、表达及纯化.....................................................291.6.1VP56原核表达质粒及诱饵质粒的构建............................................291.6.2诱导表达及可溶性分析......................................................................291.6.3目的蛋白纯化......................................................................................301.7多克隆抗体的制备和鉴定.....................................................................301.7.1多克隆抗体的制备..............................................................................301.7.2血清抗体特异性分析..........................................................................301.8酵母双杂交筛选与VP56可能相互作用的宿主蛋白.........................301.8.1诱饵重组质粒和文库质粒转染酵母菌AH109..................................301.8.2pGBKT7-VP56自激活检测..............................................................301.8.3营养缺陷培养基筛选阳性菌落...........................................................301.8.4质粒pGADT7插入片段.....................................................................301.9在酵母中鉴定蛋白VP56和Gc-JAM-A相互作用.............................312.结果................................................................................................................312.1S7和GcJAM-A目的基因的扩增..........................................................312.2重组质粒的构建.....................................................................................312.3重组蛋白rVP56的诱导表达及可溶性分析........................................322.4rVP56表达条件的优化及纯化..............................................................322.5多克隆抗体的制备及其特异性分析.....................................................332.6诱饵重组质粒pGBKT7-VP56自激活检测..........................................342.7营养缺陷培养基筛选阳性菌..................................................................342.8阳性菌落中质粒pGADT7插入片段测序结果分析............................352.9在酵母中鉴定蛋白VP56和Gc-JAM-A相互作用..............................353.讨论................................................................................................................36第四章II型GCRV中VP56缺失株的鉴定与分析......................381.材料与方法....................................................................................................381.1主要仪器设备.........................................................................................381.2试验病毒及细胞.....................................................................................381.3试验试剂及药品.....................................................................................381.4所用软件.................................................................................................381.5JX02S1-S9序列ORF的克隆................................................................391.5.1总RNA的提取及cDNA第1条链的合成........................................391.5.2引物设计及JX02S1-S9序列ORF的扩增.......................................391.5.3JX02S1-S9序列ORF的测序和分析.................................................401.6JX02和JX02WS7基因比较.................................................................401.7利用多抗血清检测JX02VP56蛋白....................................................402.结果................................................................................................................402.1JX02S1-S9序列ORF的扩增和分析....................................................402.2JX02和JX02WS7基因的比对.............................................................422.2利用多抗血清检测JX02VP56蛋白.....................................................43VIII 上海海洋大学硕士论文.3讨论................................................................................................................43结论.............................................................45发表论文...........................................................46参考文献...........................................................47致谢...............................................................53IX 上海海洋大学硕士论文引言1.我国草鱼养殖概况草鱼是我国养殖的传统四大家鱼之一，因其食性简单，饵料来源广，且生长迅速，个体大，产量高，所以广受水产养殖户的亲睐，成为是我国重要的淡水经[1,2]济鱼类之一，其年产量达到360万吨。市场上的草鱼因价格低廉，营养价值高，而深受广大居民的喜爱，成为我国居民食用蛋白获取的重要来源。但是随着养殖规模的扩大、养殖密度不断增大和工业饲料的推广，引起水质恶化和病害频发，这些都严重打击了我国水产事业的快速发展。据报道，每年因病害引起的损失约[3]占草鱼总产量的30%，在这些草鱼疾病中，细菌、真菌、病毒、原生动物、蠕虫及甲壳动物均能够成为病原，但以细菌、寄生虫和病毒性疾病为主。引起草鱼细菌性的病原很多，主要包括嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、肠型点状气单胞菌等，患病鱼肠表现为烂鳃、出血、肠炎3种症状，并且发病越来越急、流行越来越快，该病的病原大多属于条件性致病菌。草鱼常见的寄生虫有车轮虫、小瓜虫、斜管虫、指环虫、中华蚤、锚头蚤、三代虫等。体内的寄生虫主要以绦虫为主，其能够堵塞肠道，影响草鱼摄食和消化吸收。病毒性疾病以呼肠孤病毒引起的草鱼出血病危害最大，因病毒病的暴发是最难预防和治疗而给草鱼养殖业带来的危[4-8]害愈来愈严重。2.草鱼呼肠孤病毒[5]草鱼呼肠孤病毒(Grasscarpreovirus,GCRV)属于水生呼肠孤病毒属（Aquareovirus），且为该种属中致病力最强的毒株，能够感染多种鱼类，如草鱼、[9,10]鲢、青鱼、稀有鮈鲫、布氏餐条、麦穗鱼等，其中对草鱼危害最大，其死亡率达到90%，且研究已证实GCRV为危害草鱼最严重的病毒性病原。GCRV的感染范围从鱼种到成鱼阶段，尤其易感染体长10cm以下的幼鱼，且死亡率高，流行广，发病季节长，每年6月下旬至9月底是主要流行季节，8月为病发高峰期，在水温25~30℃最易流行。肉眼可观察到患病草鱼体表、肌肉和肠等器官大量出血，引起[11]内脏组织坏死，死亡率极高。根据我国研究者数十年的不断探索和钻研以及现代分子生物学技术在水产领域的开展应用，对草鱼呼肠孤病毒认识越来越深入，并取得很多可喜的成果转化为生产应用领域，为我国的水产事业健康可持续发展1 上海海洋大学硕士论文作出了巨大贡献。2.1草鱼呼肠孤病毒的发现我国科学家针对草鱼出血病的研究最早开始于20世纪50年代，1955年倪达[12]书等就怀疑当年患肠炎病的草鱼可能为病毒性病原引起的。1970年中国科学院水生生物研究所针对出血病鱼体分离细菌病原失败后，采用病毒学方法分离病毒性病原，发现分离出的病原可以在草鱼肌肉单层细胞和性腺单层细胞中感染并能够出现细胞病变现象，同时开展了理化性质研究，并最终确定了草鱼出血病是由病毒引起的。此后，研究者借助电镜技术观察证实到病鱼体组织中存在排列整齐的晶格形病毒颗粒，病毒呈球形或六角形，平均直径为69nm,从而确定为病毒感染。至到1983年，该病毒才被确定为双股RNA型，并正式命名为草鱼呼肠孤病[13]毒(Grasscarpreovirus,GCRV)。随后，呼肠孤病毒854株、861株、873株等多[14-28]株毒株被分离到。1991年国际病毒分类委员会第五次会议决定将水生呼肠孤[29][30]病毒属作为一个新属被单列入呼肠孤病毒科，并将草鱼出血病病毒纳入该属。2.2草鱼呼肠孤病毒的形态结构及理化特性GCRV为双链RNA病毒，隶属水生呼肠孤病毒属，呼肠孤病毒科。GCRV病毒粒子形态结构和正呼肠孤病毒相似，在负染色电镜下观察呈现为5∶3∶2对称[31,32]的正二十面体球形结构，直径约为65-72nm，病毒RNA核心直径约50nm，其外为双层蛋白质衣壳，无囊膜。GCRV粒子在pH3-10的范围内较稳定，对氯仿和乙醚均不敏感，并在一定的温度变化范围内是稳定的，完整病毒颗粒在CsCl密度33梯度离心的浮力密度为1.37g/cm，蔗糖梯度离心为1.305g/cm，沉降系数为550S，GCRV对鸡红细胞能够引起高密度凝集，这种凝集能被特异性抗血清所抑制；草[33][34]鱼出血病病鱼肠道的凝集价最高。GCRV具有弱的凝集人“O”型红血球的能力，[35]在用胰蛋白酶或精氨酸处理后其病毒滴度均略有上升。GCRV病毒粒子主要由蛋白质和核酸组成，以及少量糖类，但并无脂类，其[36]中糖类与蛋白质结合成为糖蛋白。GCRV基因组由11个片段组成，根据片段分子量大小不同，可以分为大片段（L1-L3），中片段（M4-M6）以及小片段（S7-S11）。目前被报道的GCRV30多个毒株基因序列相似度极低，且在鱼体和细胞水平的表[37-43][44]现也各不相同，根据基因序列不同将其分为3个基因型：I、II和III型代表株分别为GCRV-873、GCRV-HZ08和HGDRV（GCRV-104）。全国流行病学调查报[45]告显示，目前II型GCRV是我国的主要流行株。2 上海海洋大学硕士论文II型GCRV共编码12种蛋白，包括2种非结构蛋白和9种结构蛋白。I型GCRV[46]被最早发现，长期以来国内将其视为模式毒株并开展深入研究。而II型GCRV毒株(HZ08、GD108、106、109、918和HuNan794)最近几年才被陆续报道，虽然II型与其它2型在鱼体水平能够同时感染草鱼，但是在细胞水平的表型却有很大不同。比如在CIK中，I型GCRV25h内即能引起典型细胞病变(CPE)，II型GCRV[47,48]却没有CPE现象，III型GCRV直到感染第6天才会出现CPE。基因组序列比较的结果显示，I、II和III型GCRV与其它呼肠孤病毒之间，甚至这不同基因型毒株间的同源性都极低；这给理解IIGCRV病毒编码蛋白的功能带来了困难。[42,43]目前已完成II型GCRV部分毒株的基因组测序工作，发现各毒株之间序列同[49][50,51]源性很高，王杭军等针对GD108株编码的VP5蛋白做了分析；曾伟伟等分别制备了VP4的单抗和NS38的多抗，并做了免疫学分析。综上目前针对II型GCRV的研究很少，对于其基因编码蛋白的功能和作用只能根据分子生物信息学[42]分析及与其它已知基因或蛋白的比较来推测，其预测如下:(1)S1编码的VP1为加帽酶，参与病毒复制时mRNA的加帽过程。(2)S2编码的VP2为RNA聚合酶，负责合成病毒基因的mRNA。(3)S3编码的VP3为ATP酶，与MRVλ1蛋白功能相似，能与病毒dsRNA连接。(4)S4编码的NS79为未知蛋白，与MRVµNS具有25%的同源性。(5)S5编码的VP5为核苷三磷酸酶，参与病毒基因组的转录过程。(6)S6编码的VP4为病毒的外衣壳蛋白，负责病毒入侵时和细胞相互作用，能够引起宿主细胞的免疫反应。(7)S7编码的VP56为病毒外纤维蛋白，参与病毒和细胞的吸附过程。(8)S8编码的VP41为未知功能的结构蛋白。（9）S9编码的VP6为病毒的核心组成，与MRVδ2相似度较高。（10）S10编码的NS38与与MRVδNS具有较高的同源性，参与与ssRNA的连接。（11）S11编码的VP35为病毒的外衣壳蛋白。2.3草鱼呼肠孤病毒感染的组织嗜性和病理变化GCRV病毒在试验室条件下能够感染草鱼肾细胞(CIK)、草鱼囊胚细胞系(GCB)、草鱼鳍条细胞(CF)、草鱼胚胎细胞系(CP-80)、草鱼吻端细胞(ZC79010)、鲫鱼囊胚培养细胞(CAB)、草鱼性腺细胞(CO)等多种草鱼细胞系，并且能够在细胞中增殖，3 上海海洋大学硕士论文其中发现CIK细胞是对该病毒最敏感的细胞系，但GCRV对BHK、Vero等哺乳动物的细胞却不敏感。GCRV病毒能够感染青鱼，鲢鱼、布氏蟹条，鳙鱼、鲫鱼、[9]团头鲂、鲤鱼，但是发现泥鳅却能够抗GCRV感染，对GCRV抗体呈阴性反应。超薄切片观察发现病毒颗粒主要存在于肾脏，肠道，鳃等组织中，肾组织细胞中[53]病毒为未成熟病毒粒子，无外膜包被；在肠道组织细胞中为成熟病毒粒子。鱼类鳃是GCRV病毒最敏感组织，也是GCRV病毒重要的传播途径。GCRV病毒感染鱼鳃血管内皮细胞后，并在该细胞中扩增，释放到血液中，进而感染鱼体肾脏、[53]肠道等敏感组织，导致出血病的发生。且有研究报道称经过糜蛋白酶(CHT)或胰[52]蛋白酶(TRY)等水解后的呼肠孤病毒变成更具感染力的亚病毒粒子，2.4草鱼呼肠孤病毒编码蛋白的免疫原性不同基因型GCRV毒株在基因序列、鱼体致病力和细胞水平的表现也各不相同，研究者通过核酸电泳、滴度测试等试验比较了不同的GCRV毒株的感染性，[54]发现不同病毒株的免疫原性也是是不同的。柯丽华等发现来源于不同地区GCRV[55]毒株的免疫原性各不同，其中I型GCRV873株的免疫原性为最强。王祎等研究发现同1株GCRV不同编码蛋白的免疫原性也各不相同，I型GCRV蛋白VP1、VP5、VP6和VP8的兔抗血清具有很好的中和作用，而VP6蛋白诱导的抗体血清效价为最高，所以认为VP6蛋白极有可能为病毒蛋白中主要的中和抗原，VP8蛋[56]白的中和效应仅次于VP6蛋白。和永杏等通过微量中和试验发现I型GCRVJX01[57]株VP5蛋白的多抗血清具有很好的中和作用。Shatkin等研究显示VP3蛋白在[28]外衣壳蛋白上可以表现出较高的中和活性。方勤等发现病毒于低温下长时间保存会降低其感染性，并且随着病毒在细胞中传代次数的增加，其在细胞水平的致病变作用也会逐渐增强并趋于稳定，但来源于不同地区不同毒株的细胞感染特性[49]仍然不同。目前针对II型GCRV编码蛋白的免疫原性研究较少，王杭军等针对[50,51]GD108株编码的VP5蛋白做了分析；曾伟伟等分别制备了VP4的单抗和NS38的多抗，并做了免疫学分析。2.5草鱼呼肠孤病毒的检测方法病毒性病原难以凭借肉眼观察得出结果，因此针对GCRV的分子检测及诊断[58-63]技术具有重要的应用价值。目前针对GCRV的分子检测方法很多，其检测灵敏度和准确率也越来越高，例如1989年研究人员运用A蛋白酶联免疫染色技术检[58][62]测到GCRV的抗原；王铁辉等利用RT-PCR技术可以确定正常鱼体是否携带4 上海海洋大学硕士论文[63]了病毒；Li.J等建立的PT-PCR方法最低检测量仅为0.1pg。相比之下，传统方法如镜检等操作麻烦、易误判，而分子生物学方法和免疫学方法则方便准确，但[64]是分子生物学方法成本高、技术性要求高，所以很难在基层养殖中得到推广。对于II型GCRV病毒病检验检疫中，已开发的核酸诊断技术虽然能够快速筛查，但由于其高灵敏性易产生假阳性。抗原和抗体能够发生特异性结合，利用该原理建立的免疫学检测方法则往往比PCR技术准确率更高，该技术越来越受到研究者[65]的重视。杨倩等利用单克隆抗体开发了针对873株的免疫学检测技术,II型[50]GCRV中目前只见到曾伟伟等制备了HZ08株VP4的单克隆抗体,但目前还没有针对II型GCRV的免疫学诊断技术被报道。2.6草鱼呼肠孤病毒的防治措施草鱼呼肠孤病毒是危害草鱼最严重的病毒性病原,我国科学研究人员对其形态结构、生物学特性以及分子生物学性质等方面开展了长达数十年的研究探索,为深入了解该病毒的致病机制和临床上的诊断和治疗提供理论和技术指导,并且取得了很多成果。70年代进行了大量的药物防治筛选工作,提出较多针对草鱼出血病的防治方法，但收效甚微，如使用含有效氯的消毒剂或其他化学药品对鱼苗、鱼种或成鱼进行药浴、口服等，传统的防治方法不仅防治效果差，对鱼体亦有危害，同时还可能会造成水体环境的污染。目前研究者根据GCRV病毒分子致病机制特点开展研制获得抗病毒药物，如[66]蛋白酶抑制剂，干扰素诱导剂，RNAi技术的运用等。章怀云等采用外源DNA处理方法，获得对GCRV敏感性低于普通草鱼的草鱼群体，其对GCRV病毒抗性显著增强，且抗病力提高3-6倍。免疫增强剂在草鱼出血病的防治上亦有应用，如[67-69]天然的免疫多糖的使用。近年来，中草药在防治鱼病中的运用也越来越多，中草药具有药性，营养性同时能够提高饲料利用率及水产动物的生产性能。当归、大黄、板蓝根、虎杖等中草药在防治草鱼出血病中得到广泛应用；同时也可以通[70]过对中草药中有效成分的提取来合成抗病毒性药物。草鱼出血病作为1种病毒性疾病，免疫预防为最有效的防治方法之一。草鱼出血病疫苗的研制对草鱼出血病的防治同样具有重要的意义。用于预防草鱼出血[71,72][73][74][75,76]病的疫苗主要包括组织灭活疫苗，减毒活疫苗，亚单位疫苗，基因疫苗等。基因疫苗作为最理想的疫苗，通过口服1次即可生效，其中还可以包含多种免疫原，因此口服化疫苗的出现将会为草鱼出血病并且的防控带来希望。5 上海海洋大学硕士论文3.本文研究的目的及意义主要由GCRV引起的草鱼出血病极大地阻碍了我国水产事业的发展，其中发现[45]II型GCRV为当前我国流行最广的毒株。当前缺少对II型GCRV的研究，其致病机制仍不清楚，并且II型GCRV与II、III型在基因组序列、鱼体致病力、细胞病变等[38-44]方面差异较大，难以参考其现有研究结论。因此当前急需开展针对Ⅱ型GCRV的研究，为临床的诊断和防治提供理论依据。本实验室从江西南昌分离得到了JX02[77]和JX02W2株II型GCRV毒株，为II型GCRV的研究提供了很好的素材。根据分子生物信息学推测，II型GCRVS6编码的VP4、S11编码的VP35以及S7[38,43,78]编码的VP56蛋白可能为病毒的外衣壳蛋白，其在病毒进入细胞环节起到重要作用并且能诱导宿主产生适应性免疫，对其开展研究有助于了解II型GCRV的致病机制以及建立免疫学检测方法。其中VP56蛋白和腺病毒纤维蛋白同源性达到[79-81]27%，猜测其可能为病毒表面的吸附蛋白，并能和宿主细胞膜上的受体相结合，[82]鉴于哺乳动物呼肠孤病毒的外纤维蛋白能特异性识别细胞表面的受体JAM-A，推测VP56也能和草鱼JAM-A蛋白发生作用。目前关于II型GCRV外衣壳蛋白和草鱼细胞是否存在相关作用以及如何作用都尚无明确报道，两者间作用机制机理也不[83,84]清楚。酵母双杂交技术常用于检测活细胞内的蛋白-蛋白之间的相互作用，该技术的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录离不开DNA结合功能域（DNAbindingdomain，BD）和转录激活结构域（activationdomain，AD）等反式转录激活因子的参与，首先将具有潜在相互作用的蛋白分别与BD和AD相融合，利用蛋白之间的相互作用使得BD和AD相互接近，从而激发下游报告基因的表达。将该系统应用于病毒成分与宿主蛋白之间的相互作用的研究，有助于阐明病毒侵染的分子机制。本研究想通过酵母双杂交技术了解II型GCRV外衣壳蛋白和宿主蛋白之间的作用关系，从而解释II型GCRV的致病机制，同时分析外衣壳蛋白的免疫原性，尝试建立起针对II型GCRV的免疫学检测方法，为II型GCRV的深入研究奠定基础。6 上海海洋大学硕士论文第一章II型GCRV外衣壳蛋白基因S6的原核表达,多克隆抗体的制备,免疫原性及其相互作用宿主蛋白分析试验1.材料与方法1.1主要仪器设备细胞恒温恒湿培养箱：上海安亭科技仪器有限公司IX71倒置式研究型显微镜：Olympos净化工作台：上海博讯实业有限公司台式高速冷冻离心机：力康生物医疗科技控股有限公司旋涡混合仪：上海琪特分析仪器有限公司PCR仪：伯乐微波炉：Galanz琼脂糖凝胶电泳仪：上海天能科技有限公司凝胶成像系统：上海天能科技有限公司恒温振荡培养床：上海博讯实业有限公司细菌恒温培养箱：上海安亭科技仪器有限公司振荡器：上海贺德试验设备有限公司4℃冷藏箱：Haier-20℃保存箱：Haier-70℃保存箱：中科美菱聚丙烯胺凝胶电泳仪：上海天能科技有限公司免疫印迹电转仪：上海天能科技有限公司基因研究型纯水仪：艾科浦NANODROP2000：ThermoScientific1.2试验病毒及细胞JX02毒株、酵母菌AH109、草鱼肾细胞(CIK)均由本实验室保存，CIKcDNA文库由本实验室构建保存。EscherichiacoliDH5α、EscherichiacoliBL21（DE3）感受7 上海海洋大学硕士论文态细胞购自天根生物科技有限公司。免疫用小鼠购自上海实验动物研究中心。1.3试验试剂及药品TMst（1）TaqDNA聚合酶、Pyrobest高保真酶、PrimeScriptⅡ1StrandcDNASynthesisKit、限制性内切酶(Bamh1,EcoR1和Xhol酶)和T4DNA连接酶、DL2000DNAMarker、ProteinMarker均购自宝生物工程(大连)有限公司；（2）2×SDSLoadingBuffer、溶菌酶、透析袋、ELISA试剂盒、TMB单组份显色液、HRP标记的羊抗鼠IgG、30%丙烯酰胺、Tris-HCl缓冲液、APS、四甲基乙二胺、IPTG等均购自上海威奥生物科技有限公司；TM（3）YPD培养基、营养缺陷型培养基、X-alpha-Gal和YeastmakerYeastTransformationSystem均购自Contech公司；@@（4）WizardSVGelandPCRClean-UpSystem和WizardPlusSVMiniprepsDNAPurficationSystem均购自普洛麦格（北京）生物技术有限公司；（5）TrizolReagent购自Invitrogen。（6）SYBRGreenI染料购自百泰克；（7）氨苄青霉素、卡那霉素、Tris碱、SDS、甘氨酸、考马斯兰R-250、EDTA均购于生工生物技术（上海）有限公司；（8）Agarose、Agar、脱脂奶粉、CFA、IFA、聚偏二氟乙烯膜(PVDF)均购自SIGMA；（9）TWEEN-20、甲醇、无水乙酸、PBS缓冲液、三氯甲烷、2-丙醇、无水乙醇均购自国药；（10）胎牛血清、0.25%Trypsin&0.02%EDTA和M199培养液均购自杭州四季青；（11）PGEX-4T-3Vector和pGBKT7Vector均购自上海古朵生物科技有限公司。（12）鼠源抗草鱼IgM单抗血清由本实验室先前制备并保存。1.4所用软件PrimerPremier5.0引物设计软件、DNAssist序列比对软件。1.5目的基因的克隆1.5.1总RNA的提取及cDNA第1条链的合成参照贴壁细胞方法用M199基础培养液(10%胎牛血清)培养CIK，并用GCRV[45,46]JX02毒株感染CIK，在28℃培养1周后，用TRIzol法提取感染JX02毒株CIK总8 上海海洋大学硕士论文RNA。®（1）吸除病毒感染CIK细胞瓶中的原液，加入1mLTRlzolReagent，常温静置5min。（2）反复均匀吹打瓶底，将液体转至新1.5mL离心管中，加入200μL三氯甲烷，充分混匀20s，常温静置5min；4℃，12000rpm15min。（4）将上层透明相转移至新1.5mL离心管中；取等量异丙醇加入，充分混匀，常温静置10min；4℃，12000rpm15min，弃上清。（5）于管中加入1mLDEPCH2O配制的75%乙醇洗涤沉淀，4℃，12000rpm离心10min。弃上清，室温放置晾干。（6）加入50μLRNase-freeWater，反复吹打、混匀，充分溶解RNA，-80℃保存。st参考1StrandcDNA合成说明书，将所提取的总RNA反转录成cDNA(1)变性：总RNA5µgRandom6Primer(50µM)1μLdNTPMixture(10mMeach)1μLRNase-FreeWaterupto10µL65°C5min,然后迅速置冰中冷却。(2)逆转录：TemplateRNAandPrimerMixture10μL5×PrimeScriptIIBuffer4μLRNaseInhibitor(40U/μl)0.5μLPrimeScriptIIRTase(200U/μl)1μLRNase-FreeWaterupto20µL混合上述样品,30°C10min，42°C60min，95°C5min，然后放置冰上结束反应，存放在-20°C冰箱。1.5.2引物设计及目的基因的扩增根据GCRVHZ08株S6基因序列并使用PrimerPremier5.0软件设计用于构建PGEX-4T-3-S6质粒、pGBKT7-VP4质粒及扩增pGADT7插入片段的引物（表1），所有引物由上海生工生物公司合成。用合成的cDNA做模板克隆S6片段，PCR总体系50μL：引物各0.5μL；10×buffer5μL；dNTP4μl；逆转录产物1μL；Pyrobest聚合酶0.25μL；加ddH2O至50μL。PCR条件如下：94℃5min，94℃55s，61℃55s，72℃2min，35cycles，72℃10min。凝胶电泳确认扩增出目的条带后，对扩增样品进行9 上海海洋大学硕士论文纯化处理并用Nanodrop检测其浓度。表1本文使用的引物序列Table1PrimersusedinthepresentstudyGeneSenseprimer（5＇-3＇）Antisenseprimer（5＇-3＇）AplicationS6GGAATTCCATATGATGGGAAACGTCCGCGGATCCGCCAAGACGGAGGAGpGBKT7cloningCAGACGAACA(Ndel)GCCAG(Bamh1)S6CGCGGATCCATGGGAAACGTCCAGCCGCTCGAGGGCCAAGACGGAGGAPGEX-4T-3ACGAACA(Bamh1)GGCCAG(Xhol)cloningInsertionCTATTCGATGATGAAGATACCCCACCGTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCPCR&SequencingAAACCTACGATT引物的酶切位点用斜体下划线标注Theitalicizedandunderlinednucleotidesrepresenttherecognitionsitesofrestrictionenzymes1.6重组表达质粒的构建、表达及纯化1.6.1VP4原核表达质粒及诱饵质粒的构建将纯化回收的PCR产物和PGEX-4T-3空质粒分别在相应温度中进行双酶切处理(体系：Bamh11μL，10×buffer3μL，PCR纯化回收产物≤200ng，加灭菌水至30μL;质粒体系：Bamh11μL，10×buffer5μL，质粒≤1μg，加灭菌水到50μL)，酶切1.5h后再纯化处理酶切样品，用T4DNA连接酶将S6目的片段和PGEX-4T-3空质粒进行连接［T4Liqase1μL，T4Liqasebuffer2.5μL，PGEX-4T-3100ng，S6目的片段400ng，加灭菌水到25μL］，16℃水浴12h后样品转化DH5α，PCR筛选阳性克隆，摇菌扩增并提取质粒，序列比对正确后，标记为PGEX-4T-3-S6。用Ndel和BamHI快切酶酶切处理纯化后的扩增样品以及pGBKT7空质粒，之后的pGBKT7-VP4质粒构建步骤参考上述PGEX-4T-3-S6。1.6.2诱导表达及可溶性分析将测序正确的PGEX-4T-3-S6质粒转化BL21，取0.1mL菌液均匀涂布到含氨苄西林（Ampr+）的LB固体平板上，挑取平板上阳性的菌株接种到5mLLB(Ampr+）培养液里，37℃振荡培育12h。再将菌液按照1:100的比例转移到新鲜的LB（Ampr+）培养液里，37℃，160r/min恒温振荡培育5h。加入IPTG进行梯度诱导(IPTG终浓度分别为0、0.1、0.3、0.5和0.7mmoL/L)，诱导4h后收集表达细菌，4℃，8000r/min离心20min；用1×PBS溶液洗涤两次，再用适量1×PBS重悬沉淀，超声破碎20min10 上海海洋大学硕士论文（6s/6s）至溶液澄清。4℃，12000r/min15min后收集上清和沉淀，利用SDS-PAGE分析原核表达rVP4的可溶性及最佳诱导条件时的IPTG浓度。1.6.3目的蛋白纯化于优化条件下大量诱导表达rVP4，依次用2，4，6，8mol/L尿素溶液对沉淀进行梯度重悬、混匀处理，每次洗涤完后4℃8500r/min20min，重新收集沉淀，接着将洗脱下的rVP4装入透析袋进行梯度透析，依次放入终浓度为6，4，2和0mol/L尿素的PBS溶液中透析，每个浓度处理5h。透析后的蛋白溶液采用BCA法微量蛋白浓度测量试剂盒测其浓度，蛋白分装后放在-80℃保存。1.7多克隆抗体的制备和鉴定1.7.1多克隆抗体的制备用纯化的rVP4免疫小鼠，200μg/只。第1次采用腹腔内注射，rVP4和等体积的弗氏完全佐剂混匀呈乳化状态后注射。14天后的第2次注射仍采用腹腔内注射，rVP4和等体积的弗氏不完全佐剂充分混匀后注射小鼠。第3次免疫在第1次免疫21天后进行，主要采用皮下注射的方式，并且是不加佐剂的纯抗原。1周后可以采取第4次免疫，注射条件同前一次。在第4次免疫3天后，可眼角取血并检验多抗血清的效果。1.7.2血清抗体特异性分析分别用纯化的rVP4以及感染了GCRVJX02病毒的CIK作为上样样品，SDS-PAGE凝胶电泳，然后采用电转膜法（100V,60min）转至PVDF膜上。用15mL含5%牛奶的PBST溶液室温震荡封闭4h，在分别用自己制备的多抗血清作为一抗（稀释度：1：3000）室温震荡封闭0.5h后4℃过夜。用PBST漂洗4次，每次8min。再用HRP标记的羊抗鼠的IgG作二抗（稀释度：1：3000）室温震荡封闭2h，用PBST清洗4次，每次8min，最后将PVDF膜置于DAB溶液里显色，目的条带清晰后用的ddH2O终止反应。1.8基于rVP4的病毒诱导抗体的免疫学检测取实验室感染的不同批次、不同时间及来自不同地区样品鱼的血液，其中感染JX02病毒的草鱼血清为实验组，而未感染病毒的健康草鱼血清作为阴性组。用11 上海海洋大学硕士论文已纯化的rVP4蛋白作为上样样品进行电泳，并以抽取部分样本血液的血清作为一抗（稀释度：1：500）室温震荡封闭0.5h后4℃过夜。用PBST清洗4次，每次8min。用抗草鱼IgM的单抗作二抗（稀释度：1：2000）。用PBST清洗4次，每次8min。接着将HRP标记的山羊抗鼠IgG抗体作为三抗，PBST清洗4次，每次8min，最后将PVDF膜放入DAB溶液中显色，目的条带清晰显示即可终止反应。1.9酵母双杂交筛选与VP4可能相互作用的宿主蛋白1.9.1诱饵重组质粒和文库质粒转染酵母菌AH109酵母感受态制备和质粒转染参照酵母转染手册。诱饵重组质粒转染酵母菌AH109:分别加入100ngpGBKT7-VP4质粒，5μLCarrierDNA（95℃变性5min后迅速置于冰上），50μL感受态到1.5mL离心管(预冷)里，混匀；加入0.5mLPEG/LiAc，混匀；30℃水浴30min，每10min轻混和数下；加入20μLDMSO，混匀；42℃15min，每5min轻混和数下；高速离心15s，吸除液体，用1mLYPDPlusMedium重悬沉淀，30℃振荡培养1h；高速离心15s，吸除液体，用1mL生理盐水重悬沉淀，取稀释后的酵母菌液100μL均匀涂布SD缺陷型培养板，于30℃恒温培养箱中倒置培养。文库质粒转染含有pGBKT7-VP4的AH109：分别取15μg文库质粒，20μLCarrierDNA（95℃变性5min后迅速置于冰上）以及0.6mL含有pGBKT7-VP4的感受态加入到15mL预冷的离心管中，混匀；加入2.5mLPEG/LiAc,混匀；30℃45min，每15min轻混和数下；加入160μLDMSO，混匀；42℃20min，每10min轻混和数下；2100r/min5min，吸除液体，用3mLYPDPlusMedium重悬沉淀，30℃振荡培养90min；2100r/min5min，吸除液体，用15mL生理盐水重悬沉淀，取稀释后的酵母菌液均匀涂布SD/-Trp/-Leu平板。1.9.2pGBKT7-VP4自激活检测分别将质粒pGBKT7-VP4和pGBKT7转染酵母菌AH109，并分别涂布SD/-Trp和SD/-Trp/-His平板，30℃倒置培育数天，观察其生长情况。1.9.3营养缺陷培养基筛选阳性菌落文库质粒转染含有pGBKT7-VP4重组质粒的AH109，并作为实验组涂布SD/-Trp-Leu平板，30℃倒置培养5d，后依次转移涂布到SD/-Trp-Leu-His平板，12 上海海洋大学硕士论文SD/-Trp-Leu-His-Ade平板，SD/-Trp-Leu-His-Ade/3-AT/X--gal平板上，筛选阳性菌落；同时将文库质粒转染含有pGBKT7质粒的AH109，其作对照组，其它参照实验组。1.9.4质粒pGADT7插入片段参照pGADT7质粒图谱设计扩增质粒pGADT7插入片段的引物（表1），挑取菌落做菌落PCR，PCR样品送由公司测序。2.结果2.1S6目的基因的扩增使用设计的引物并用试验提取的JX02株cDNA作为模板，成功克隆获得S6目的片段。PCR产物经过电泳显现为约1954bp特异性条带，大小和预期相同(图1)。图1S6基因PCR扩增产物电泳图M1.marker2000；S6.PCR扩增产物Fig.1ElectrophoreticprofileofPCRproductsofS6gene.M1.marker2000；S6.amplificationproducts2.2重组质粒的构建使用DNAssist软件比对序列，结果确定重组质粒PGEX-4T-3-S6和pGBKT7-VP4都构建准确，将PGEX-4T-3-S6质粒转化大肠杆菌后可以用于诱导表达rVP4，即GST-VP4融合蛋白，同样将pGBKT7-VP4质粒转染酵母菌能够形成BD-VP4融合蛋白。13 上海海洋大学硕士论文2.3重组蛋白rVP4的诱导表达及可溶性分析SDS-PAGE结果显示，经诱导的菌体沉淀于98ku位置显现出明显的目的蛋白条带，但在未诱导的菌体中则没有发现该目的条带(图2)。由于rVP4主要出现在沉淀中，所以本试验揭示rVP4主要是以包涵体的形式存在。图2重组蛋白rVP4的诱导表达及可溶性分析M.蛋白质marker；1.未诱导细菌沉淀；2.诱导细菌沉淀；3.诱导细菌超声破碎后的上清；4.诱导细菌超声破碎后的沉淀Fig.2InducedexpressionandsolubilityanalysisofrVP4proteinM.proteinmarker;1.theprecipitateofuninducedbacterialcontrol;2.theprecipitateofinducedbacterialcontrol;3.thesupernatantofinducedbacyterialafterultrasonic;4.theprecipitateofinducedbacterialafterultrasonic2.4rVP4表达条件的优化及纯化SDS-PAGE结果对比发现，0.1mmol/L浓度的IPTG诱导时，rVP4的目标条带较为明显，证明rVP4能达到较高的表达量；而随着IPTG浓度提高时目标条带并无明显的变化，证明rVP4的表达量并无显著性增减，所以根据本实验室之前蛋白诱导经验，把rVP4的IPTG浓度定为0.3mmol/L即能够达到很好的诱导效果（图3）。图3不同浓度IPTG对rVP4的诱导效果M.蛋白质marker；1.未诱导菌体的沉淀；2.0.1mm浓度诱导的菌体沉淀；3.0.3mm浓度诱导的菌体沉淀；4.0.5mm浓度诱导的菌体沉淀；5.0.7mm浓度诱导的菌体沉淀14 上海海洋大学硕士论文Fig.3EffectofIPTGconcentrationontheexpressionofrVP4M.proteinmarker;1.theprecipitateofuninducedbacterial;2.theprecipitateofbacterialinducedby0.1mMIPTG;3.theprecipitateofinducedbacterialinducedby0.3mMIPTG;4.theprecipitateofinducedbacterialinducedby0.5mMIPTG;5.theprecipitateofbacterialinducedby0.7mMIPTG纯化的rVP4采用紫外吸光光度法检测其质量浓度约为2mg/mL。SDS-PAGE结果分析显示，rVP4样品经过透析后目的条带单一且显著，几乎没有了杂带(图4)，表明纯化的效果较好(图4)。图4rVP4纯化产物的SDS-PAGE分析M.蛋白marker;1.未诱导的沉淀；2.0.3mm浓度诱导的沉淀；3.透析后的样品Fig.4SDS-PAGEofpurifiedrVP4M.proteinmarker;1.theprecipitateofuninducedbacterial;2.theprecipitateofbacterialinducedwith0.3mMIPTG;3.purifiedsampleafterdialysis2.5多克隆抗体的制备及其特异性分析Westernblot结果显示，rVP4样品中出现了大小约为98ku的目的条带，病毒蛋白样品中出现了大小约为72ku的单一条带，这和VP4大小相同（图5），以上结果证明了获得的抗VP4多抗血清能和rVP4产生特异性结合，同时也能够特异性5识别JX02病毒粒子上的VP4蛋白且条带单一。ELISA试验测得血清效价约1:4×10，表明血清效价较高。图5Western-blot检测rVP4重组蛋白M.Marker；1.病毒蛋白；2.rVP4重组蛋白Fig.5Western-blotdetectionofrVP4M.proteinmarker;1.Virusparticlesample;2.recombinantproteinrVP415 上海海洋大学硕士论文2.6基于rVP4的病毒诱导抗体的免疫学检测Western-blot检测结果显示，rVP4样品中的实验组（一抗为感染病毒的鱼血清）在约98ku处存在目的条带，而阴性对照组（一抗为健康鱼血清）没有出现目的条带（图6）。以上结果证明了rVP4具有病毒粒子相应衣壳蛋白一样的免疫原性，初步判断可以用于作为捕获抗原来检测草鱼体内的相应抗体。图6基于rVP4的Western-blot检测M.Marker；1:阴性对照组；2-9:实验组Fig.6Western-blotClinicaltestM.Marker;1:negativecontrol;2-9:positivecontrol.2.7诱饵重组质粒pGBKT7-VP4自激活检测自激活试验发现，分别携带pGBKT7-VP4和pGBKT7质粒的AH109都能够于SD/-Trp平板上生长且长势较好，但在SD/-Trp/-His平板上都无法生长（图7），表明表达的VP4对AH109不产生的毒性，即pGBKT7-VP4诱饵质粒在酵母中不存在自激活作用。图7质粒pGBKT7-VP4自激活检测结果Fig.7DetectionofpGBKT7-VP4self-activation1：SD/-Trpplates；2：SD/-Trp/-Hisplates2.8营养缺陷培养基筛选阳性菌落用VP4作为诱饵从CIK文库中筛选鉴定和其作用的潜在宿主蛋白，最终得到4株阳性菌落（图8）。16 上海海洋大学硕士论文A-D:Positivecolones图8营养缺陷培养基筛选的阳性菌落Fig.8Screeningofpositiveclonesonselectionplates2.9阳性菌落中质粒pGADT7插入片段测序结果分析对阳性菌落进行菌落PCR扩增，并将PCR样品送公司测序，利用GeneBank上Blast软件分析测序序列并最终确定了4个宿主蛋白（表2）。表2酵母双杂交筛选与II型GCRV蛋白VP4有潜在相互作用的基因列表Table2GenelistofGCRVII-VP4interactorsscreenedbyYeasttwo-hybridsystemColonyNo.GenedescriptionAccessionnumberACtenopharyngodonidellaclaudinbKF193860BapolipoproteinBmRNAeditingenzyme,catalyticpolypeptide-like2a(apobec2a)[DanioNM_001013314rerio]CS100calciumbindingproteinA10b(s100a10b)[Daniorerio]NM_213003DGrasscarp(C.idella)beta-actinCTEACTBB3.讨论GCRV是对草鱼危害最大的病毒性病原，该病毒的暴发极大地阻碍了我国水产事业的快速发展。根据最新的流行病学调查发现，II型GCRV是当前我国流行范围最广的毒株。当前缺乏对II型GCRV株的深入研究，也无法参考其它型GCRV的研究结果。II型GCRV蛋白VP4是由S6编码的651个氨基酸组成，且与水生呼肠孤病毒VP4蛋白,哺乳动物正呼肠孤病毒μ1蛋白及禽呼肠孤病毒μB蛋白都有较高的相似性[42]，由此推测VP4可能是该病毒的主要衣壳蛋白，也有研究者运用生物学软件对S6[38]编码蛋白的结构进行了分析和推测。以上的结论为探讨VP4蛋白在病毒进入细胞时发挥的作用提供了方向。但目前关于VP4蛋白和草鱼细胞是否存在相关作用以及如何作用还未见报道，两者的相互作用机制也不清楚。酵母双杂交技术(Yeasttwo-hybridsystem)可以模拟在真核体系内验证蛋白之间的作用关系，目前，该系统已经广泛应用在I型GCRV入侵机制的研究上：丁燏等发现了和NS38，VP7作用的宿主蛋白，为其生物学功能的深入研究提供了基17 上海海洋大学硕士论文[87,88][89]础数据；方勤等研究NS38和NS80作用并说明了NS80和VFLS形成有关；本实验室利用酵母双杂交系统成功筛选出了和JX01株外衣壳蛋白VP5作用的宿主表面吸附蛋白，并且发现了多个和NS26作用的草鱼先天免疫相关基因，如LITAF[90,91]因子和Ajuba蛋白。而II型GCRV的研究主要集中在基因组测序以及部分蛋[37,38]白的免疫原性上，对于其相互作用蛋白的研究还未见报道。据推测VP4蛋白为外衣壳蛋白，其和宿主蛋白间的作用在病毒感染细胞环节起着重要的作用，所以加强对VP4作用蛋白的研究利于人们进一步了解病毒的致病机制,为草鱼出血病的防治方法开拓新思路。本研究克隆获得了负责编码GCRVJX02株外衣壳蛋白VP4的S6基因,并且成功构建到原核表达载体上，通过IPTG诱导、纯化获得了重组蛋白rVP4。SDS-PAGE结果显示，表达的rVP4以包涵体的形式存在，用纯化的rVP4免疫小鼠，获得抗VP45多抗血清，通过ELISA测得血清效价约为1:4×10。Westernblot结果表明，VP4多抗血清既可识别原核表达的rVP4，同时能识别JX02毒株上的VP4蛋白，并且发现感染JX02的草鱼血清中存在结合VP4的相应抗体，说明了本试验制备的多克隆抗体具有良好的生物学特性，并且rVP4重组蛋白作为相应抗体捕获原可以用于确诊草鱼是否感染II型GCRV。证明试验构建的pGBKT7-VP4质粒在酵母中无自激活作用，用VP4作诱饵从草鱼cDNA文库中成功筛选确定4个作用蛋白，这些发现将为探究VP4在病毒侵入宿主细胞时的相关作用研究提供可能，这4个蛋白和VP4在草鱼细胞内的作用关系将是今后的研究重点。本研究将为GCRV主要流行株血清学检测方法的建立以及VP4蛋白相关功能研究提供了可能。18 上海海洋大学硕士论文第二章II型GCRV外衣壳蛋白基因S11的原核表达,多克隆抗体的制备,免疫原性及其相互作用宿主蛋白分析试验1.材料与方法1.1主要仪器设备与第一章1.1相同。1.2试验病毒及细胞与第一章1.2相同。1.3试验试剂及药品Ndel,EcoR1和Xhol限制性快切酶购自Takara公司，其它与第一章1.3相同。1.4所用软件PrimerPremier5.0引物设计软件、DNAssist序列比对软件。1.5目的基因的克隆1.5.1总RNA的提取及cDNA第1条链的合成与第一章1.5.1相同。1.5.2引物设计及目的基因的扩增根据HZ08株S11基因序列并使用PrimerPremier5.0软件设计构建PGEX-4T-3-S11质粒、pGBKT7-VP35诱饵质粒及扩增pGADT7插入片段的引物（表1），引物由上海生工生物公司合成。用合成的cDNA作模板克隆S11片段，扩增体系和条件参考第一章1.5.2。用凝胶电泳检测样品扩增出目的片段后，纯化扩增样品并用Nanodrop检测其浓度。19 上海海洋大学硕士论文表1本文使用的引物序列Table1PrimersusedinthepresentstudyGeneSenseprimer（5＇-3＇）Antisenseprimer（5＇-3＇）AplicationS11GGAATTCCATATGATGGAACCAGCACCGGAATTCCCACTGTCCCTGGATCTpGBKT7cloningAAACCACTG(Ndel)CAGGT(EcoR1)S11CCGGAATTCCATGGAACCAGCAAAACCGCTCGAGGGCCACTGTCCCTGGAPGEX-4T-3CCACTG(EcoR1)TCTCAGGT(Xhol)cloningInsertionCTATTCGATGATGAAGATACCCCACCGTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCPCR&SequencingAAACCTACGATT引物的酶切位点用斜体下划线标注Theitalicizedandunderlinednucleotidesrepresenttherecognitionsitesofrestrictionenzymes1.6重组表达质粒的构建、表达及纯化1.6.1VP35原核表达质粒及诱饵质粒的构建PGEX-4T-3-S11和pGBKT7-VP35质粒构建参考第一章1.6.1。1.6.2诱导表达及可溶性分析将测序正确的PGEX-4T-3-S11重组质粒转化BL21，其诱导步骤与第一章1.6.2相同，但诱导rVP35的IPTG终浓度依次为0、0.1、0.3、0.5、0.7和0.9mmol/L。1.6.3目的蛋白纯化VP35重组蛋白的纯化步骤与第一章1.6.3相同。1.7多克隆抗体的制备和鉴定1.7.1多克隆抗体的制备VP35多克隆抗体的制备步骤与第一章1.7.1相同。1.7.2血清抗体特异性分析分别用纯化的rVP35以及感染了GCRVJX02病毒的CIK作为上样样品，用获得的抗VP35多抗血清作为一抗（稀释度：1：3000），Westernblot步骤参考第一章1.7.2。20 上海海洋大学硕士论文1.8基于rVP35的病毒诱导抗体的免疫学检测用已纯化的rVP35蛋白作为上样样品，血清学检测步骤参考第一章1.8。1.9酵母双杂交筛选与VP35可能相互作用的宿主蛋白1.9.1诱饵重组质粒和文库质粒转化酵母菌AH109酵母感受态的制备，pGBKT7-VP35质粒和文库质粒转染步骤参考第一章1.9.1。1.9.2pGBKT7-VP35自激活检测分别将pGBKT7-VP35和pGBKT7质粒转染AH109，然后涂布SD/-Trp和SD/-Trp/-His平板，30℃培养数天，观察其生长情况。1.9.3营养缺陷培养基筛选阳性菌落文库质粒转染含有pGBKT7-VP35质粒的AH109，并作为实验组涂布SD/-Trp-Leu平板，30℃平板倒置培养5d，依次用SD/-Trp-Leu-His平板，SD/-Trp-Leu-His-Ade平板，SD/-Trp-Leu-His-Ade/3-AT/X--gal平板筛选阳性菌落；文库质粒转染含有pGBKT7质粒的AH109，其作对照组，其它参照实验组。1.9.4质粒pGADT7插入片段参考第一章1.9.4。2.结果2.1S11目的基因的扩增使用设计的引物并用试验提取的JX02株cDNA作模板，克隆获得S11目的片段。扩增样品经电泳显现为约933bp特异性条带，大小和预期相同(图1)。21 上海海洋大学硕士论文图1S11基因PCR扩增产物电泳图M1.marker1000；S11.PCR扩增产物Fig.1ElectrophoreticprofileofPCRproductsofS11gene.M1.marker1000；S11.amplificationproducts2.2重组质粒的构建使用DNAssist软件比对序列，结果表明重组质粒PGEX-4T-3-S11和pGBKT7-VP35都构建准确，将PGEX-4T-3-S11质粒转化BL21可以用于诱导表达rVP35，即GST-VP35融合蛋白，同样将pGBKT7-VP35质粒转染AH109能够形成BD-VP35融合蛋白。2.3重组蛋白rVP35的诱导表达及可溶性分析SDS-PAGE结果显示，诱导后的菌体沉淀于61ku位置处显现目的蛋白条带，未诱导的菌体中则不存在该条带(图2)。由于rVP35大量出现在沉淀中，所以本试验揭示rVP35主要是以包涵体的形式存在。图2重组蛋白rVP35的诱导表达及可溶性分析M.蛋白质marker；1.未诱导细菌沉淀；2.诱导细菌沉淀；3.诱导细菌超声破碎后的上清；4.诱导细菌超声破碎后的沉淀Fig.2InducedexpressionandsolubilityanalysisofrVP35proteinM.proteinmarker;1.theprecipitateofuninducedbacterialcontrol;2.theprecipitateofinducedbacterialcontrol;3.thesupernatantofinducedbacyterialafterultrasonic;4.theprecipitateofinducedbacterialafterultrasonic22 上海海洋大学硕士论文2.4rVP35表达条件的优化及纯化SDS-PAGE结果对比发现，0.1mmol/L浓度的IPTG诱导时，rVP35的目标条带较为明显，证明rVP35能达到较高的表达量；而随着IPTG浓度提高时目标条带并无明显的变化，证明rVP35表达量并无显著性增减，所以根据本实验室之前蛋白诱导经验，把IPTG浓度定为0.3mmol/L即能够达到很好的rVP35诱导效果（图3）。图3不同浓度IPTG对rVP35的诱导效果M.蛋白质marker；1.未诱导菌体的沉淀；2.0.1mm浓度诱导的菌体沉淀；3.0.3mm浓度诱导的菌体沉淀；4.0.5mm浓度诱导的菌体沉淀；5.0.7mm浓度诱导的菌体沉淀；6.0.9mm浓度诱导的菌体沉淀Fig.3EffectofIPTGconcentrationontheexpressionofrVP35M.proteinmarker;1.theprecipitateofuninducedbacterial;2.theprecipitateofbacterialinducedby0.1mMIPTG;3.theprecipitateofinducedbacterialinducedby0.3mMIPTG;4.theprecipitateofinducedbacterialinducedby0.5mMIPTG;5.theprecipitateofbacterialinducedby0.7mMIPTG;6.theprecipitateofbacterialinducedby0.9mMIPTG纯化的rVP35利用紫外吸光光度法检测其质量浓度约为3mg/mL。SDS-PAGE结果分析显示，透析后的rVP35样品相比透析前杂带大量减少，且以目标条带为主，表明纯化的效果较好(图4)。图4rVP35纯化产物的SDS-PAGE分析M.蛋白marker;1.未诱导的沉淀；2.0.3mm浓度诱导的沉淀；3.透析后的样品Fig.4SDS-PAGEofpurifiedrVP3523 上海海洋大学硕士论文M.proteinmarker;1.theprecipitateofuninducedbacterial;2.theprecipitateofbacterialinducedwith0.3mMIPTG;3.purifiedsampleafterdialysis2.5多克隆抗体的制备及其特异性分析Westernblot结果显示，rVP35样品中出现了大小约为61ku的目的条带，病毒蛋白样品中出现了大小约为35ku的单一条带，这与VP35大小一致（图5），以上结果表明获得的抗VP35多抗血清可以和rVP35产生特异性免疫结合，同时也能够特异性识别感染CIK中GCRVJX02病毒粒子上的VP35蛋白且条带单一。ELISA6方法测得抗VP35血清效价约为1:10，表明多抗血清效价较高。图5Western-blot检测rVP35重组蛋白M.Marker；1.病毒蛋白；2.rVP35重组蛋白Fig.5Western-blotdetectionofrVP35M.proteinmarker;1.Virusparticlesample;2.recombinantproteinrVP352.6基于rVP35的病毒诱导抗体的免疫学检测Western-blot检测结果显示，rVP35样品中的实验组（一抗为感染病毒的鱼血清）于61ku处存在目的条带，而阴性对照组（一抗为健康鱼血清）没有出现目的条带（图6）。以上结果证明了rVP35具有病毒粒子相应衣壳蛋白一样的免疫原性，初步判断可以用于作为捕获抗原来检测草鱼体内的相应抗体。图6基于rVP35的Western-blot检测M.Marker；1:阴性对照组；2-10:实验组Fig.6Western-blotClinicaltestM.Marker;1:negativecontrol;2-10:positivecontrol.2.7诱饵重组质粒pGBKT7-VP35自激活检测自激活试验发现，分别含有pGBKT7-VP35和pGBKT7质粒的AH109都能够于SD/-Trp平板上生长且生长良好，但在SD/-Trp/-His平板上都无法生长（图7），24 上海海洋大学硕士论文表明VP35对AH109不产生毒性，即pGBKT7-VP35质粒在酵母中没有自激活特性。图7质粒pGBKT7-VP35自激活检测结果Fig.7DetectionofpGBKT7-VP35self-activation1：SD/-Trpplates；2：SD/-Trp/-Hisplates2.8营养缺陷培养基筛选阳性菌落用VP35作诱饵从CIK文库中鉴定和其作用的潜在宿主细胞蛋白，最终获得16株阳性菌落（图8）。1-16:Positivecolones图8营养缺陷培养基筛选的阳性菌落Fig.8Screeningofpositiveclonesonselectionplates2.9阳性菌落中质粒pGADT7插入片段测序结果分析PCR扩增检测阳性菌株，并将扩增样品送由公司测序以确定pGADT7插入基因，测序结果经GeneBank上Blast软件分析，最终确定16个宿主蛋白（表2）。表2酵母双杂交筛选与II型GCRV蛋白VP35有潜在相互作用的基因列表Table2GenelistofGCRVII-VP35interactorsscreenedbyYeasttwo-hybridsystemColonyNo.GenedescriptionAccessionnumber1Danioreriopyrroline-5-carboxylatereductase1b(pycr1b),transcriptvariantX1，XM_00516942025 上海海洋大学硕士论文2Daniorerioparathyroidhormone2receptor(pth2r),transcriptvariantX1,XM_0051676613DaniorerioEGFcontainingfibulin-likeextracellularmatrixprotein2a(efemp2a),NM_0010085874Daniorerioproteasomesubunitbeta7(psmb7),mRNANM_0010455645Ctenopharyngodonidellatissueinhibitorofmetalloproteinase2(timp2)mRNA,HQ1538326Danioreriomuscle-specificbeta1integrinbindingprotein2(mibp2),mRNA,NM_1988777Danioreriokeratin18，BC0658488Daniorerioneuron-derivedneurotrophicfactor(ndnf),XM_6848429DaniorerioN(alpha)-acetyltransferase10,NatAcatalyticsubunit(naa10),NM_21333410Daniorerioeukaryotictranslationelongationfactor2b(eef2b),mRNANM_20045811CtenopharyngodonidellacollagentypeIalpha2(COLlA2)mRNA,HM77124112Mylopharyngodonpiceusbeta-actinmRNA,KP18512813DanioreriomethionineadenosyltransferaseII,alpha-like(mat2al),transcriptvariantXM_009305102X1,mRNA14Daniorerioadenylosuccinatesynthase,mRNA(cDNAcloneIMAGE:5601443),withBC055595apparentretainedintron15anioreriosolutecarrierfamily44(cholinetransporter),member2(slc44a2),transcriptXM_005165750variantX3,mRNA16DanioreriolactatedehydrogenaseB4,mRNA(cDNAcloneMGC:55551BC044190IMAGE:2642766),3讨论GCRV是对草鱼危害最大的病毒性病原，该病毒的暴发极大地阻碍了我国水产事业的快速发展，其中IIGCRV是当前我国流行范围最广的毒株，并且该毒株和其它毒株在基因组序列、毒力、细胞培养特性等方面均存在较大差异。相比研究较为深入的GCRV-873株而言，II型GCRV株并未进行过深入研究，病毒蛋白的结构和功能主要是通过分子生物信息学分析技术推测得出的。针对II型GCRV编码蛋白功能的研究不仅有助于对该病毒的深入了解，而且能够为一线草鱼出血病提供免疫学诊断新理论指导。蛋白之间的作用关系是基因价值体现的重要方式，因此可以通过蛋白之间的作用研究来了解基因及其编码蛋白的用途。酵母双杂交技术用于模拟在真核体系内开展蛋白间作用关系研究，目前，该系统已被应用在I型GCRV与宿主细胞作26 上海海洋大学硕士论文用机制的研究。而II型GCRV的研究主要集中在其基因组测序以及部分蛋白的免[37,38]疫原性上，对于其相互作用蛋白的研究还未见报道。据推测S11基因编码VP35[43]蛋白可能为II型GCRV的外衣壳蛋白，病毒粒子表面蛋白与宿主细胞的相互作用在其入侵宿主环节起着重要的作用，所以加强对VP35相互作用蛋白的研究有助于人们进一步了解病毒的致病机制,为寻求防治草鱼出血病的方法开拓新思路。酵母双杂交技术经过20多年不断发展和完善，成为了蛋白研究的重要方式并得到学术界较高的认可，但是酵母双杂交Gal4系统本身仍然存在着一些缺点使其假阳率[92,93]和假阴率难以避免，所以研究中还需要通过免疫共沉淀和Pull-down等其它实验技术来进一步提高实验结果的准确性。本研究克隆获得了负责编码GCRVJX02株外衣壳蛋白的S11基因,并且成功构建到原核表达载体上，通过IPTG诱导、纯化获得了重组蛋白rVP35。SDS-PAGE结果表明，rVP35主要以包涵体的形式存在，用纯化的rVP35免疫小鼠，获得多抗血6清，通过ELISA测得血清效价约为1:10。Westernblot分析表明，获得多抗血清既可识别rVP35，同时能识别JX02毒株上的VP35蛋白，并且发现感染JX02的草鱼血清中存在结合VP35的相应抗体，说明了本实验制备的多克隆抗体具有良好的生物学特性，并且rVP35作为相应抗体捕获原可以用于确诊草鱼是否感染II型GCRV。证明试验构建的pGBKT7-VP35质粒在酵母中无自激活作用后，用VP35作为诱饵从草鱼cDNA文库中成功筛选出了16个酵母阳性菌落，初步确定16个相关蛋白，这些发现将为探究VP4在病毒侵入宿主细胞时的相关作用研究提供可能，这16个蛋白和VP35在草鱼细胞内的作用关系将是今后的研究重点。本研究将为GCRV主要流行株血清学检测方法的建立以及VP35蛋白相关功能研究奠定了基础。27 上海海洋大学硕士论文第三章II型GCRV外衣壳蛋白基因S7的原核表达,多克隆抗体的制备及其相互作用宿主蛋白分析试验1.材料与方法1.1主要仪器设备与第一章1.1相同。1.2试验病毒及细胞GCRVJX02W毒株由本实验室2012年从江西南昌草鱼养殖区分离得到一株II型GCRV毒株，其它与第一章1.2相同。1.3试验试剂及药品NcoI,Bamh1和Xhol限制性快切酶购自Takara公司，pGADT7Vector购自上海古朵生物科技有限公司，其它与第一章1.3相同。1.4所用软件PrimerPremier5.0引物设计软件、DNAssist序列比对软件。1.5目的基因的克隆1.5.1总RNA的提取及cDNA第1条链的合成[45,46]用TRIzol法提取携带JX02W毒株的患病草鱼组织总RNA。（1）称取患病草鱼肠、肾等组织0.1g，置于无菌研钵中均匀研磨呈泥状后，用匀浆仪进行匀浆处理，将匀浆分装至1.5mL无菌eppendorf管中，加入1mL®TRlzolReagent，混匀，室温放置5min。（2）加入200μL三氯甲烷，充分混匀20s，常温静置5min；4℃，12000rpm离心15min。（4）取上层透明液相（约0.5mL）加入1.5mL新离心管里；加0.5mL异丙醇，充分混匀，常温静置10min；4℃，12000rpm离心15min，弃上清。（5）于管中加入1mLDEPCH2O配制的75%乙醇洗涤沉淀，4℃，12000rpm离心28 上海海洋大学硕士论文10min。弃上清，室温放置晾干。（6）加入50μLRNase-freeWater，反复吹打、混匀，充分溶解RNA，-80℃保存。cDNA合成步骤参考第一章1.5.1相同。1.5.2引物设计及目的基因的扩增根据HZ08株S7序列并使用PrimerPremier5.0软件设计构建PGEX-4T-3-S7原核表达重组质粒、pGBKT7-VP56诱饵质粒及扩增pGADT7插入片段的引物（表1），引物由上海生工生物公司合成。用合成的cDNA作模板克隆S7片段，扩增体系和条件参考第一章1.5.2。凝胶电泳检测样品中扩增出S7片段后，纯化扩增样品并用Nanodrop检测其浓度。GcJAM-A基因克隆参照本方法。表1本文使用的引物序列Table1PrimersusedinthepresentstudyGeneSenseprimer（5＇-3＇）Antisenseprimer（5＇-3＇）AplicationS7CATGCCATGGAGATGGCCACTCGTGCGCGGATCCGGTACTTACAGCAAACpGBKT7cloningACAG(NcoI)TACCGT(Bamh1)GcJAMA-ACGCGGATCCCGATGTTGACTTTCGTCCCGCTCGAGGGTACACCACAAAAGApGADT7cloningTTTG(Bamh1)TGATT(Xhol)S7CGCGGATCCATGGCCACTCGTGACACCGCTCGAGGGCCACTTACAGCAAAPGEX-4T-3GCCGC(Bamh1)CTACCGTCCAA(Xhol)cloningInsertionCTATTCGATGATGAAGATACCCCACCGTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCPCR&SequencingAAACCTACGATT引物的酶切位点用斜体下划线标注Theitalicizedandunderlinednucleotidesrepresenttherecognitionsitesofrestrictionenzymes1.6重组表达质粒的构建、表达及纯化1.6.1VP56原核表达质粒及诱饵质粒的构建PGEX-4T-3-S7和pGBKT7-VP56质粒构建参考第一章1.6.1。1.6.2诱导表达及可溶性分析将测序正确的PGEX-4T-3-S7质粒转化BL21，其诱导表达的步骤参考第一章1.6.2，但诱导rVP56的IPTG终浓度依次是0、0.1、0.3、0.5、0.7和0.9mmol/L。29 上海海洋大学硕士论文1.6.3目的蛋白纯化VP56重组蛋白的纯化步骤与第一章1.6.3相同。1.7多克隆抗体的制备和鉴定1.7.1多克隆抗体的制备VP56多克隆抗体的制备步骤与第一章1.7.1相同。1.7.2血清抗体特异性分析以纯化的rVP56作上样样品，SDS-PAGE凝胶电泳，用获得的抗VP56多抗血清作一抗，Westrenblot步骤参考第一章1.7.2。1.8酵母双杂交筛选与VP56可能相互作用的宿主蛋白1.8.1诱饵重组质粒和文库质粒转染酵母菌AH109酵母感受态的制备，pGBKT7-VP56质粒和文库质粒的转染步骤参考第一章1.9.1。1.8.2pGBKT7-VP56自激活检测分别将pGBKT7-VP56和pGBKT7质粒转染AH109，并涂布SD/-Trp和SD/-Trp/-His平板，30℃平板倒置培养数天，观察其生长情况。1.8.3营养缺陷培养基筛选阳性菌落文库质粒转染含有pGBKT7-VP56质粒的AH109，将其作为实验组并涂布SD/-Trp-Leu平板，平板倒置30℃培养5d，依次用SD/-Trp-Leu-His平板，SD/-Trp-Leu-His-Ade平板，SD/-Trp-Leu-His-Ade/3-AT/X--gal平板筛选阳性菌落；文库质粒转染含有pGBKT7质粒的AH109，其作对照组，其它参照实验组。1.8.4质粒pGADT7插入片段参考第一章1.8.4。30 上海海洋大学硕士论文1.9在酵母中鉴定蛋白VP56和Gc-JAM-A相互作用为验证II型GCRVVP56蛋白和GcJAM-A蛋白存在相互作用这一推测，将pGADT7-GcJAM-A质粒和pGBKT7-VP56诱饵质粒共转染AH109，并作为实验组涂布SD/-Trp-Leu平板，30℃倒置培养5d，然后转移至SD/-Trp-Leu-His平板上，30℃培养5d；对照组将pGADT7质粒和pGBKT7-VP56诱饵质粒共转染AH109，并涂布在SD/-Trp-Leu平板上，30℃培养5d，然后将生长的菌落转移到SD/-Trp-Leu-His平板上。2.结果2.1S7和GcJAM-A目的基因的扩增使用设计的引物并用试验提取的JX02W株cDNA作模板，克隆获得S7和GcJAM-A目的片段。扩增样品经过电泳显现为约1539bp特异性条带，大小和预期相同(图1)。从草鱼CIK细胞cDNA中扩增得到大小约为888bpGcJAM-A基因片段（图1）。图1S7基因和GcJAMA-A基因PCR扩增产物电泳图M1.marker2000；S7.PCR扩增产物；2.GcJAM-APCR扩增产物Fig.1ElectrophoreticprofileofPCRproductsofS7andGcJAMA-AgenesM1.marker2000；S7.amplificationproducts；2.GcJAM-APCRproduct2.2重组质粒的构建使用DNAssist软件比对序列，结果表明质粒PGEX-4T-3-S7、pGBKT7-VP56和pGADT7-GcJAM-A都构建正确，将PGEX-4T-3-S7质粒转化进BL21后可以用于诱导表达rVP56，即GST-VP56融合蛋白，同样将pGBKT7-VP56和pGADT7-GcJAM-A质粒转染AH109能够分别形成BD-VP56和AD-GcJAM-A融合蛋白。31 上海海洋大学硕士论文2.3重组蛋白rVP56的诱导表达及可溶性分析SDS-PAGE结果显示，诱导后的菌体沉淀于83ku处显现出目的条带，未诱导的菌体中则没有该条带(图2)。由于rVP56大量出现在沉淀里，所以本试验揭示rVP56主要是以包涵体的形式存在。图2重组蛋白rVP56的诱导表达及可溶性分析M.蛋白质marker；1.未诱导细菌沉淀；2.诱导细菌沉淀；3.诱导细菌超声破碎后的上清；4.诱导细菌超声破碎后的沉淀Fig.2InducedexpressionandsolubilityanalysisofrVP56proteinM.proteinmarker;1.theprecipitateofuninducedbacterialcontrol;2.theprecipitateofinducedbacterialcontrol;3.thesupernatantofinducedbacyterialafterultrasonic;4.theprecipitateofinducedbacterialafterultrasonic2.4rVP56表达条件的优化及纯化SDS-PAGE结果对比发现，0.1mmol/L浓度的IPTG诱导时，rVP56的目标条带较为明显，证明rVP56能达到较高的表达量；而随着IPTG浓度提高时目标条带并无明显的变化，即证明rVP56表达量并无显著性增减，所以根据本实验室之前蛋白诱导经验，把rVP56的IPTG浓度定为0.3mmol/L即能够达到很好的诱导效果（图3）。图3不同浓度IPTG对rVP56的诱导效果M.蛋白质marker；1.未诱导菌体的沉淀；2.0.1mm浓度诱导的菌体沉淀；3.0.3mm浓度诱导的菌体沉淀；4.0.5mm浓度诱导的菌体沉淀；5.0.7mm浓度诱导的菌体沉淀32 上海海洋大学硕士论文Fig.3EffectofIPTGconcentrationontheexpressionofrVP56M.proteinmarker;1.theprecipitateofuninducedbacterial;2.theprecipitateofbacterialinducedby0.1mMIPTG;3.theprecipitateofinducedbacterialinducedby0.3mMIPTG;4.theprecipitateofinducedbacterialinducedby0.5mMIPTG;5.theprecipitateofbacterialinducedby0.7mMIPTG紫外吸光光度法测得纯化的rVP56质量浓度约为3mg/mL。SDS-PAGE结果分析显示，rVP56样品经过透析后目的条带单一且显著，几乎没有了杂带，表明纯化的效果较好(图4)。图4rVP56纯化产物的SDS-PAGE分析M.蛋白marker;1.透析后的样品；2.0.3mm浓度诱导的沉淀Fig.4SDS-PAGEofpurifiedrVP56M.proteinmarker;1.purifiedsampleafterdialysis;2.theprecipitateofbacterialinducedwith0.3mMIPTG2.5多克隆抗体的制备及其特异性分析Westernblot结果显示，rVP56样品中出现了大小约为83ku的目的条带（图5），表明获得的抗VP56多抗血清可以和rVP56产生特异性免疫结合。ELISA方法测6得血清效价达到1:10，表明抗VP56多抗血清的效价较高。图5Western-blot检测rVP56重组蛋白M.Marker；1.rVP56重组蛋白33 上海海洋大学硕士论文Fig.5Western-blotdetectionofrVP56M.proteinmarker;1.recombinantproteinrVP562.6诱饵重组质粒pGBKT7-VP56自激活检测自激活试验发现，分别含有pGBKT7-VP56和pGBKT7质粒的AH109都能够在SD/-Trp平板上生长，却不能够在SD/-Trp/-His平板上生长（图6），表明表达的VP56对AH109不产生毒性，即pGBKT7-VP56质粒在酵母中没有自激活作用。图6质粒pGBKT7-VP56自激活检测结果Fig.6DetectionofpGBKT7-VP56self-activation1：SD/-Trpplates；2：SD/-Trp/-Hisplates2.7营养缺陷培养基筛选阳性菌用VP56作诱饵从CIK文库中筛选鉴定与其相互作用潜在宿主蛋白，试验最终获得9株阳性菌落（图7）。A-I:Positivecolones;1:SD/-Trp-Leu-His-Ade;2:SD/-Trp-Leu-His-Ade/3-AT/X--gal图7营养缺陷培养基筛选的阳性菌落(×2)Fig.7Screeningofpositiveclonesonselectionplates(×2)34 上海海洋大学硕士论文2.8阳性菌落中质粒pGADT7插入片段测序结果分析PCR检测阳性菌株，将扩增样品送由公司测序，使用GeneBank上Blast软件对测序结果进行比对分析，发现A,D,F,H,I为确定蛋白；B,C,E为预测蛋白；而G为未知蛋白（表2）。表2酵母双杂交筛选与II型GCRV蛋白VP56有潜在相互作用的基因列表Table2GenelistofGCRVII-VP56interactorsscreenedbyYeasttwo-hybridsystemColonyNo.GenedescriptionAccessionnumberAEGF-containingfibulin-likeextracellularmatrixprotein2precursor[Daniorerio]NM_001008587BPREDICTED:protein-glutaminegamma-glutamyltransferase2isoformX1[Daniorerio]XM_682306CDaniorerioparathyroidhormone2receptor(pth2r),transcriptvariantX1,mRNAXM_005167661DRNA-bindingprotein48[Daniorerio]BC091857EPREDICTED:DaniorerioserineproteaseHTRA2,mitochondrial-like(LOC799537),BC153517TranscriptvariantX1,mRNAFNucleolarproteinfamilyA,member2(H/ACAsmallnucleolarRNPs)[Daniorerio]BC059569GCyprinuscarpiogenomeassemblycommoncarpgenome,scaffoldLG5LN590709HES1proteinhomolog,Mitochondrial[Daniorerio]NM_001017662IGlutathioneS-transferaseomega1[Daniorerio]NM_0010026212.9在酵母中鉴定蛋白VP56和Gc-JAM-A相互作用转染pGADT7-GcJAM-A和pGBKT7-VP56质粒的AH109能够在SD/-Trp-Leu生长，证明这两种质粒都被成功转染到AH109中，但是在SD/-Trp-Leu-His平板上却无菌落；对照组情况相同，也是在SD/-Trp-Leu上能够生长，但在SD/-Trp-Leu-His无法生长（图8）。结果表明，II型GCRVVP56蛋白与GcJAM-A蛋白在酵母菌中不存在相互作用。35 上海海洋大学硕士论文1：SD/-Trp-Leuplates；2：SD/-Trp-Leu-Hisplates图8在酵母中鉴定蛋白VP56和Gc-JAM-A相互作用结果Fig.8IdentificationofVP56proteininteractingwithGc-JAM-A.3.讨论国内外关于II型GCRV主要有GCRV-HZ08，GCRV-GD108，GCRV-109三株全[42,44,94][48,49]基因组测序完成，GCRV-JX02有部分基因序列。II型GCRV蛋白VP56研究很少，仅有其全序列和相关生物信息学分析，与其它蛋白同源性比对等相关数[43,78]据报道。据推测S7编码的VP56可能为II型GCRV的外纤维蛋白，其在病毒入侵宿主环节起着重要的作用，所以针对VP56蛋白开展研究可以让人们更多了解到病毒的致病机制。本研究预通过酵母双杂交试验从草鱼cDNA文库中鉴定与外衣壳VP56蛋白相互作用的潜在宿主蛋白，同时验证VP56与GcJAM-A蛋白存在相互作用这一猜测。本研究构建了pGBKT7-VP56诱饵质粒，发现其在酵母中不存在自激活作用，并且以pGBKT7-VP56为诱饵从草鱼cDNA文库中鉴定获得9个酵母阳性菌落，初步确定8个和其作用的宿主蛋白，为VP56在病毒感染中的作用研究提供了基础和可能。遗憾的是在所获得的宿主蛋白中我们没有发现细胞膜蛋白，通常除了具有识别受体功能外，病毒粒子外纤维蛋白还具有其它重要的生物学功能，接下来我们将在细胞水平深入研究这8个蛋白与VP56的相互作用。已有研究证明JAM-A蛋白为哺乳动物呼肠孤病毒的细胞表面受体，其能够与哺乳动物呼肠孤病毒外纤维[95,96]蛋白特异性相互作用，GcJAM-A蛋白有一个典型的跨膜结构域。II型GCRV与其它2型GCRV序列同源性低于20%，其更接近于哺乳动物呼肠孤病毒，推测II型GCRV外纤维蛋白VP56可能与草鱼细胞膜上JAM-A蛋白相互作用。本试验中我们成功构建pGADT7-GcJAM-A重组质粒，并使用酵母杂交系统证明了VP5636 上海海洋大学硕士论文蛋白和GcJAM-A蛋白在酵母中不发生相互作用，初步排除VP56作为病毒衣壳吸附蛋白与宿主表面膜蛋GcJAM-A相结合介导病毒感染的可能性。同时将S7基因成功构建到原核表达载体上，诱导、纯化获得了重组蛋白rVP56。SDS-PAGE分析显示，rVP56主要以包涵体的形式存在，用其免疫小鼠，获得anti-VP56多抗血清，5通过ELISA检测抗体效价约为1:4×10。Westernblot结果表明，获得的抗VP56多抗血清能够识别原核表达的rVP56重组蛋白。本研究为近一步应用细胞生物学技术探讨II型GCRV外衣壳蛋白VP56的功能及建立II型GCRV免疫学检测方法奠定了基础。37 上海海洋大学硕士论文第四章II型GCRV中VP56缺失株的鉴定与分析.1.材料与方法1.1主要仪器设备与第一章1.1相同。1.2试验病毒及细胞JX02和JX02W毒株、CIK细胞均由本实验室保存。1.3试验试剂及药品TMst（1）Pyrobest高保真酶、PrimeScriptⅡ1StrandcDNASynthesisKit、DL2000DNAMarker、ProteinMarker均购自宝生物工程(大连)有限公司；（2）2×SDSLoadingBuffer、HRP标记的羊抗鼠IgG、30%丙烯酰胺、Tris-HCl缓冲液、APS、四甲基乙二胺等蛋白相关试剂均购自上海威奥生物科技有限公司；@（3）WizardSVGelandPCRClean-UpSystem购自普洛麦格（北京）生物技术有限公司；（4）TrizolReagent购自Invitrogen公司。（5）SYBRGreenI染料购自百泰克；（6）Tris碱、SDS、甘氨酸、EDTA购于生工生物技术有限公司；（7）Agarose、Agar、脱脂奶粉、CFA、IFA、聚偏二氟乙烯膜(PVDF)均购自SIGMA；（8）TWEEN-20、甲醇、无水乙酸、PBS缓冲液、三氯甲烷、2-丙醇、无水乙醇均购自国药；（9）胎牛血清、0.25%Trypsin&0.02%EDTA和M199培养液购自杭州四季青。1.4所用软件PrimerPremier5.0引物设计软件、EditSeq、DNAMAN序列比对软件。38 上海海洋大学硕士论文1.5JX02S1-S9序列ORF的克隆1.5.1总RNA的提取及cDNA第1条链的合成参考第一章的1.5.11.5.2引物设计及JX02S1-S9序列ORF的扩增根据HZ08株的基因组序列并使用PrimerPremier5.0设计克隆S1-S9序列ORF的引物（表1），引物由上海生工生物公司合成。用合成的cDNA作模板对GCRVJX02S1-S9序列ORF进行PCR扩增，扩增体系和条件参考第一章的1.5.2。所有PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。(S1,S2,S3,S5)等基因被分为两段分别扩增，测序完之后用EditSeq软件将同一基因的不同片断拼接起来。表1本文使用的引物序列Table1PrimersusedinthepresentstudyPrimerSequenceAmpliconlength(bp)S1-1RAAGATGGCATTGTTTGGAT2402S1-1FAAGAATGATGGGGTAACGAS1-2RGTTTCCAACATAGAACCGCCC1731S1-2FATCTATGAGACCACACGGACTAACTS2-1RTTTTTCTGATGATGGACC2395S2-1FCACCCAAGTAGGCAACATAATS2-2RCTCATAGACTACGGTGGACT1527S2-2FCTACACTTTTCGCATCCACATCS3-1RATGCATCGTCATAACAGAAC2482S3-1FTCACACCAATAGTCGTTCCAGTS3-2RACTGGAACGACTATTGGTGTGA1239S3-2FTTACTCTACTCCCGCCATAGTTCCCS4RTTGAGCTACTCCTGGCAACATG2198S4FAGTGAGCGAGAGACATAAATGAGGTS5-1RAGCGATGTTACTCATTCTGCC1340S5-1FCAAAGGTGGGTGATACCGTGTS5-2RGCGGGCAACACGGTATCAC898S5-2FATATACCACGGCATGGGGTAATS6FCCTAAGACGGAGGAGGCCAGTATCG195439 上海海洋大学硕士论文S6RATGGGAAACGTCCAGACGAACAGCS7RAAGATGGCCACTCGTGACA1554S7FCCAGCACGCACTTTACTTACAGS8RATTTAGACCTTTCCTATCACCC1144S8FCCTTGCCATTACATTTACGGS9RTTTAGAGTCGACGCATGTAT1298S9FAGGTCCTAAGGGAATAAGCGA1.5.3JX02S1-S9序列ORF的测序和分析各扩增样品经纯化后送由上海生工生物公司测序。使使用GenBankBLAST软件对GCRVJX02测序序列和GCRVHZ08序列进行比对，并将GCRVJX02测序序列上传至GenBank数据库中。1.6JX02和JX02WS7基因比较JX02W株总RNA的提取和cDNA的合成参考第三章的1.5.1；感染JX02毒株的CIK细胞总RNA的提取和cDNA的合成参考第一章的1.5.1，同时用本实验室内未感染病毒的CIK细胞做对照。根据HZ08株的S7序列设计扩增中间缺失片段的引物（上游：5'-CGCACACCAAACTTCCAACG-3'；下游5'-AGCCCCCCCACTGGACATAG-3'），引物由上海生工生物公司合成。使用该引物并用合成的cDNA作模板扩增目的片段，凝胶电泳检测扩增样品。1.7利用多抗血清检测JX02VP56蛋白分别用纯化的rVP56和感染JX02毒株的CIK作为上样样品，同时用本实验室内未感染病毒的CIK做阴性对照，进行WesternBlot试验，分别利用抗VP56和抗VP35多抗血清作为一抗（稀释度：1：3000），最后将PVDF膜放入DAB溶液中显色，目的条带清晰后用的ddH2O终止反应。2.结果2.1JX02S1-S9序列ORF的扩增和分析使用设计的引物并用JX02株cDNA作模板，克隆获得S1-S9序列ORF片段（图1），并将所有测序序列上传至GenBank数据库中（基因登录号：KM880065,KM880066,40 上海海洋大学硕士论文KM880067,KM880068,KM880069,KM880070,KM880071,KM880072,andKM880073）。图1JX02S1-S9基因PCR扩增产物电泳图M1.marker2000；S1-1.S1-2:S1基因2段PCR扩增产物;S2-1.S2-2:S2基因2段PCR扩增产物;S3-1.S3-2:S3基因2段PCR扩增产物;S5-1.S5-2:S5基因2段PCR扩增产物;S4，S6，S7，S8，S9:S4，S6，S7，S8，S9基因PCR扩增产物Figure1.SequenceingoftheS1-S9fragmentsoftheGCRVJX02strain.使用DNAssist软件对GCRVJX02测序序列和GCRVHZ08序列进行比对，发现这2株病毒基因序列同源性高达99%（表2）。但是JX02S7基因序列的ORF存在着431bp的缺失片断（图2），HZ08S7ORF序列全长为1539bp，JX02S7序列缺失段分别位于50-54bp和566-991bp处。HZ08S7基因负责编码VP56蛋白，由于JX02缺乏完整的S7序列，所以我们推测VP56蛋白并不是病毒复制所必需的。表2GCRVJX02株和GCRVHZ08株基因组ORFs序列比对Table2.Comparisonofthevirus-encodedORFsbetweenGCRVJX02andGCRVHZ08.Gene/JX02HZ08NucleotideProteingenomeAccessionORFAccessionORFidentityidentityfragmentnumberlengthnumberlengthbetweenbetween(bp)(bp)JX02andJX02andHZ08(%)HZ08(%)VP1/S1KM8800653885GQ89633438859999VP2/S2KM8800663822GQ89633538259998VP3/S3KM8800673699GU35074236999999NS79/S4KM8800682151GU35074321519999VP5/S5KM8800692181GQ89633621819999VP4/S6KM8800701953GQ89633719539999VP56/S7KM8800711108GU350744153998NAVP41/S8KM8800721086GU3507451086999841 上海海洋大学硕士论文VP6/S9KM8800731257GU35074612579999NS38/S10JX2633031038GU35074710389999VP35/S11JQ042808933GU3507489339999NA,noaccess;ORF,openreadingframe.HZ08_S7_ORF.seqATGGCCACTCGTGACAGCCGCATGACTACAGAGCACGTTATCGCCCTAATTCTCGCATACTCCACAACTTTAGATGAAGCAAAGATACACGAAGAGATTA100JX02_S7_ORF.seqATGGCCACTCGTGACAGCCGCATGACTACAGAGCACGTTATCGCCCTAA.....GCATACTCCACAACTTTAGATGAAGCAAAGATACACGAAGAGATTA95HZ08_S7_ORF.seqCGAATCTGCAGTCGGCAGTGGCGCAACTGACAGCGCGATTGACAGAGTTGACTGATGCGGTGACTAGCTTTGATGCACGCTTAACCCAAGTAGAACAGCA200JX02_S7_ORF.seqCGAATCTGCAGTCGGCAGTGGCGCAACTGACAGCGCGATTGACAGAGTTGACTGATGCGGTGACTAGCTTTGATGCACGCTTAACCCAAGTAGAACAGCA195HZ08_S7_ORF.seqGGTTAGTAAATTGGACAACAAGATTGGGATACTATCTAACAGGATAGGCGCCAACACCGCCAGTATGAATTTCTTGGCTGGCATAGTGGATGCGACGAGA300JX02_S7_ORF.seqGGTTAGTAAATTGGACGACAAGATTGGGATACTATCTAACAGGATAGGCGCCAACACCGCCAGTATGAATTTCTTGGCTGGCATAGTGAATGCGACGAGA295HZ08_S7_ORF.seqATAGATGCAGTGGACGTACCACTATACATATATATAGTCGATGACCAGAGGCGCCTCGCAATAGCCACGGGAGAAGGGTTATTTGTGAAAGATCAGAAGT400JX02_S7_ORF.seqATAGATGCAGTGGACGTACCACTATACATATATATAGTCGATGACCAGAGGCGCCTCGCAATAGCCACGGGAGAAGGGTTATTTGTGAAAGATCAGAAGT395HZ08_S7_ORF.seqTAAACGGGTACGATGTGCGTAGCTTTCCACCTATAGCCGTCGCTAAATATAATAACATATTATCGTTCTCGCTGAGCTCAGCCCCCCCACTGGACATAGT500JX02_S7_ORF.seqTAAACGGGTACGATGTGCGTAGCTTTCCACCTATAGCCGTCGCTAAATATAATGACATATTATCGTTCTTGCTGAGCTCAGCCCCCCCACTGGACATAGT495HZ08_S7_ORF.seqTGATGGTAAGTTGGCTGTCAGCACAACTAGCAGGCTATTCATCACCAGTGGAAAATTAGACACTAATTCATATACCGGTTCATCGAGTGTGGACATATCT600JX02_S7_ORF.seqTGATGGTAAGTTGGCTGTCAGCACAACTAGCAGGCTATTCATCACCAGTGGAAAATTAGACACTA...................................560HZ08_S7_ORF.seqGGAGCGACGGAAGAAAAGACGGTGAGCGTTAGAACGATTAACCCCATCATTGCAGGTCAGGATGGCTTGTCCCTATCACTAAGCGGTGTCCTGGAGGTCG700JX02_S7_ORF.seq....................................................................................................560HZ08_S7_ORF.seqGCGCTGGCTTATTACTATCAGGTAGGTCTTGGCCCCTTACATTGGATCTACGTGTGAGTACCCCATTAGCATATGACCATACCGGAGGATTATCCGTTGT800JX02_S7_ORF.seq....................................................................................................560HZ08_S7_ORF.seqAACACGGTATCCCTTAGATGTGACGTCTGCTGGCATGGGTGTCAACATGCAGGTGCCCCTACGGCTAAACTGTGTCGACTTAGGATTGGCATACAATACG900JX02_S7_ORF.seq....................................................................................................560HZ08_S7_ORF.seqCAGGATTTTTCGATAGTTGACGGATATTTGACTTTGAACAGGTCCCAAGGAAAATTGGAGGAACTCGGTGAGGTGGTCAACATGAACGCTACTCTAGTCG1000JX02_S7_ORF.seq...........................................................................................CTCTAGTCG569HZ08_S7_ORF.seqACTTAAATGACGGTGGATTGCAGGCTCTAGAGACAGATTTAAGCTTGGAGAAGACTCTTAACGCTATGCAATGCCTATTTGAGCATGAGGGTACATGGCG1100JX02_S7_ORF.seqACTTAAATGACGGTGGATTGCAGGCTCTAGAGACAGATTTAAGCTTGGAGAAGCCTCTTAACGCTATGCAATGCCTATTTGAGCATGAGGGTACATGGCG669HZ08_S7_ORF.seqTTGGAAGTTTGGTGTGCGAATGTCCACGGAACCGACGATTACAACTGTTCGTGTTAATGTTCACAGCACTTGGTCTGTCGATGTCCAGGAATCAATAGCA1200JX02_S7_ORF.seqTTGGTAGTTTGGTGTGCGAATGTCCACGGAACCGACGATTACAACTGTCCGTGTTAATGTTCACAGCACTTGGTCTGTCGCTGTCCAGGAATCAATAGCA769HZ08_S7_ORF.seqATCTGCGCGATAACCACCACTACGGCTGGAGCTGGTAAAGGACAGGGGCCCCGGGTGACTATTCCTTTCAGAAGAGCTGATCTCACCGATGATATGATGC1300JX02_S7_ORF.seqATCTGCGCGATAACCACCACTACGGCTGGAGCTGGTAAAGGACACGGGCCCCGGGTGACTATTCCTTTCAGAAGAGCTGATCTCACCGATGATATGATGC869HZ08_S7_ORF.seqGTGCAGGCTTCGATGTGTGGAAGAGCGATTATATCAGGAAGGAAGCATTTGTAGGTACGTTACGTGGCCTCTACCGACGATGGTCCGACAAGCATCTACT1400JX02_S7_ORF.seqGTGCAGGCTTCGATGTGTGGAAGAGCGATTATATCAGGGAGGAAGCATTTGTAGGTACGTTACGTGGCCTCTACCGACGATGGTCCGACAAGCATCTACT969HZ08_S7_ORF.seqTACGGAATTCTACGCACACGGCCGTCTCTATCCAACTGAGGATGGCATCAAGTTGATTTTAACACCTAGGTCTACGGATGACGAGTATGAGTGGGCTGGT1500JX02_S7_ORF.seqTACGGAATTCTACGCACACGGCCGTCTCTATCCAACTGAGGATGGCATCGAGTTGATTTTAACATCTAGGTCTACGGATGACGAGTATGAGTGGGCTGGT1069HZ08_S7_ORF.seqCTGCGTAATGTGCATTGGACGGTAGTTTGCTGTAAGTA1538JX02_S7_ORF.seqCTGCGTAATGTGCATTGGACGGTAATTTGCTGTAAGTA1107图2GCRVJX02株和GCRVHZ08株S7ORF序列比对图Figure2.AlignmentoftheS7ORFofJX02andHZ08strains.2.2JX02和JX02WS7基因的比对使用扩增缺失部分序列的引物，并以JX02，JX02W以及未感染病毒CIK的cDNA为模板对S7基因进行扩增。发现JX02W株S7基因中间片断大小约为639bp，扩增条带大小和预期相同；而JX02S7基因中间片断约为213bp，扩增条带大小比与预期小400多bp（图3），证明了JX02株S7基因存在着缺失片断，而JX02W株S7基因片段完整。同时发现本实验室内保存的未感染病毒CIK也能够检测到II型GCRVS7基因，并且和JX02株目的片断大小一样。42 上海海洋大学硕士论文图3JX02和JX02WS7基因PCR扩增产物电泳图M.marker2000Fig.3ElectrophoreticprofileofPCRproductsofS7genebetweenJX02andJX02Wstrains.2.3利用多抗血清检测JX02VP56蛋白Westernblot结果显示，用抗VP56多抗血清作一抗时，rVP56样品中出现了大小约为83ku的目的条带，而JX02病毒样品和未感染病毒的CIK样品中都未出现目的条带；用抗VP35多抗血清作一抗时，JX02病毒样品和未感染病毒的CIK样品中都出现了大小约为35ku的单一条带，这和VP35大小相同（图6）。以上结果表明JX02病毒粒子上不存在VP56蛋白，并且本实验室保存的CIK细胞中携带着II型GCRV缺失株。图6Western-blot检测rVP56重组蛋白Fig.6Western-blotdetectionofrVP56M.Marker3.讨论GCRV是危害草鱼最大的病毒性病原,该病毒的暴发极大地阻碍了我国水产事业的快速发展。对比哺乳动物呼肠孤病毒和其它水生呼肠孤病毒，GCRV被认为是43 上海海洋大学硕士论文高度宿主特异性，但这种特异性也遭到了学术界的质疑，因为GCRV不同型之间的基因同源性极低，根据基因序列不同，GCRV可分为I，II，III型，其中II型被认为是我国流行范围最广的毒株。相比研究较为深入的GCRV-873株而言，II型GCRV株并未进行过深入研究，其病毒蛋白的结构和功能主要是通过分子生物信息学分析方法推测得出的。针对II型GCRV开展研究不仅有助于对该病毒的深入了解，而且能够为一线草鱼出血病的检测和治疗提供新理论依据。GCRVJX02和JX02W株分别是本实验室2011和2012年从江西南昌分离得到[77]的II型GCRV毒株，经全基因组测序比对发现，JX02负责编码VP56蛋白的S7ORF存在着431bp的缺失片段，而JX02它基因序列和HZ08株同源性高达99%。但值得注意的是，在I型GCRV基因组中找不到与II型GCRVS7基因同源性相似的基因，但VP56与III型GCRVVP55基因同源性达到15.1%，并且VP55与VP56的分子质量非常接近，亲水性相似，据推测其为参与细胞吸附作用的外纤维蛋白，所以II和III[78]型GCRV可能在进化上更为接近，但是II和III型GCRV所有基因序列同源性不超[97]过47%，所以GCRV在基因型上可以分为3个不同类型。同样本研究利用之前制备的抗VP56蛋白的多克隆抗体也没有检测出JX02病毒粒子上存在VP56蛋白，以上的实验结果表明，外纤维蛋白VP56可能并不是病毒感染宿主所必需的，但这种现象并没有发生在其它种属的呼肠孤病毒。之前有报道称经过糜蛋白酶（CHT）或[52]胰蛋白酶（TRY）等水解后的呼肠孤病毒变成更具感染力的亚病毒粒子，也就是说病毒外纤维蛋白虽然起着吸附宿主表面的作用，但它却并不是病毒感染细胞时所必须具备的。试验同时检测到本试验室保存的CIK细胞中也携带着II型GCRV突变株，本研究尚未能够解释清楚这一现象，是细胞传代过程中被感染了亦或是本实验室先前保存的原始细胞系中本身就携带着病毒，这一问题还需要接下来更多的实验结果来解释。本研究发现负责编码JX02VP56蛋白的S7ORF存在着431bp的缺失片段，VP56为病毒外纤维蛋白负责在病毒入侵宿主时吸附细胞，所以证明了JX02株可能为II型GCRV中的突变株。这种序列缺失现象可能干扰到VP56蛋白的形成，以此推测VP56蛋白可能并非病毒感染过程必需的。II型GCRV有3个外衣壳蛋白,VP56蛋白存在着缺失现象,那么VP4和VP35蛋白将在病毒入侵宿主细胞中起着重要作用,这两个蛋白将是我们接下来的研究重点。体外实验都发现JX02株并没有导致细胞出现CPE现象或者鱼体有临床发病迹象，就下来我们将研究突变株与完整株在致病方面的不同作用。本研究为II型GCRV的深入研究提供基础资料。44 上海海洋大学硕士论文结论本论文针对II型GCRV三个编码外衣壳蛋白基因开展研究，得出以下结论：1、II型GCRV外衣壳蛋白基因S6、S11和S7的克隆研究表明：根据HZ08株基因序列设计引物，提取感染JX02株CIK总RNA和携带JX02W株患病草鱼组织总RNA并以此为模板，利用RT-PCR技术扩增获得目的基因。其中JX02株S6和S11基因ORF长度分别为1954bp、933bp，JX02W株S7基因ORF长度为1539bp。2、II型GCRV外衣壳蛋白VP4、VP35、VP56的表达和多克隆抗体免疫原性研究表明：原核表达的外衣壳蛋白都主要以包涵体形式存在，各重组蛋白大小分别为98kDa，61kDa和83kDa。获得的三种多抗血清都能识别其原核表达的目的蛋白，其中抗VP4和VP35多抗血清也能识别JX02株上的对应蛋白，并且发现感染JX02的草鱼血清中存在结合rVP4和rVP35的相应抗体。ELISA测得三种抗体效价分别566约为1:4×10，1:10，1:10。3、酵母双杂交鉴定相互作用宿主蛋白的研究表明：构建的3个诱饵质粒在酵母中都无自激活作用，并且从CIK文库中筛选确定4个和VP4作用的CIK蛋白，16个和VP35作用的CIK蛋白，以及8个和VP56作用蛋白，并且证明了VP56蛋白和GcJAM-A蛋白在酵母中无相互作用。4、II型GCRV中VP56缺失株的研究表明；JX02株编码VP56蛋白的S7ORF存在着431bp的缺失片段，而其它基因序列和HZ08株同源性高达98%，同时JX02W株S7序列是完整的。Westernblot结果显示，JX02病毒粒子上并不存在VP56蛋白。本试验对II型GCRV外衣壳蛋白的免疫原性和相互作用的潜在宿主蛋白进行了初步分析，同时发现II型GCRV中存在着VP56缺失株，为II型GCRV的深入研究及建立针对其的免疫学检测方法奠定了基础。45 上海海洋大学硕士论文发表论文1.宗乾坤，张也，吕利群.II型草鱼呼肠孤病毒VP4、VP35蛋白的多克隆抗体制备及其免疫原性分析.水产学报,2016，40(3):355-362.2.宗乾坤，徐丽娟，吕利群.嗜水气单胞菌性鲫败血症的盐酸沙拉沙星用药方案研究.西北农林科技大学学报,2016，44(6):46-52.3.喻飞，王浩，宗乾坤，等.草鱼呼肠孤病毒GCRVVP56相互作用蛋白的鉴定.水产学报，2016，40(3):371-378.4.宗乾坤，王浩，盛佳璐，等.利用酵母双杂交技术筛选与II型草鱼呼肠孤病毒VP4蛋白相互作用的宿主蛋白.已投稿上海海洋大学学报。46 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上海海洋大学硕士论文致谢岁月如梭，光阴荏苒，三年的研究生生活转眼即将结束，回首往昔，海大给我留下了刻骨铭心的记忆。宁静的校园，优良的学风，严谨的科研氛围，整洁忙碌的实验室，还有实验室内朝夕相处的同窗们……点点滴滴都让我感慨万千，值此毕业论文完成之际，我谨向所有关心、帮助我的人们表示最诚挚的感谢与最美好的祝愿。在离校临别之际，我首先要感谢我的硕士生导师吕利群教授。本论文从选题到写作的每一步都是在吕老师的悉心指导之下完成的。三年来，导师以渊博的专业知识，严谨的治学态度，精益求精的工作作风，诲人不倦的高尚师德对我影响深远。导师不仅在科研的道路上引领我，而且教诲我做人的道理，这些时刻都在激励我、鼓舞我，并将为我未来的人生道路指引方向，在此我向吕老师表示深切的谢意与祝福!本论文的完成也离不开其他各位老师、同学和朋友的关心与帮助。在此要感谢许丹老师在学习和生活上给于的亦师亦友的帮助和指导，感谢张也老师在论文写作中所提出的宝贵意见，感谢病原库的老师们在试验中给予的帮助和支持，在此向他们表示诚挚的谢意！感谢同窗邱玮晨、鲁建飞，感谢师兄王浩、徐晓雁、党云飞、张楠、沈晓宝、李炎、宋浪，师姐黄美秀、徐丽娟、李梦影、张娅楠，师弟张国亮、孙朋辉、俞飞、盛佳璐，师妹孔善云、刘倩、张敏利、夏思瑶、刘玮莎、沈兆媛，在试验和生活上对我的帮助以及照顾。最后我要深深感谢我的父母和家人在我求学生涯中一直以来的支持和鼓励。同时感谢操银萍、马文元、徐华东、李振伟、关文志等2016届同学三年来培我一起度过的那些快乐并辛苦的日子！本论文得到现代农业产业技术体系建设专项（No.CARS-46-12）的资助，谨以致谢。宗乾坤二零一六年四月于上海53