南方养殖草鱼呼肠孤病毒分子特性的分析与vp4重组蛋白免疫效果初步的的研究

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1、上海海洋大学硕士学位论文99．4％，各样品与GCRV-GDl08株序列的相似性在95．O‰99．8％间；样品间同源性最高的为S9片段，L3片段的同源性最低，各样品M4片段问的差异较大。本研究说明目前南方多个地区的草鱼出血病病毒均具有与GCRV-GDl08株相似的分子特征，提示GCRV-GDl08株是南方省市的主要代表性流行毒株。此外，还进行了病毒感染组织特异性的分析，结果显示各组织样品均能检测到特异条带，说明各组织中均感染有病毒。2．双重PCR扩增方法的建立在上述检测基础上筛选合适引物对，以健康草鱼、GCRV标准株

2、以及GCRv．GDl08株基因组RNA为模板，反转录所获得的eDNA进行双重PCR扩增，结果显示健康草鱼无特异条带产生，GCRV标准株样品均有450bp左右的条带，而GCRV-GDl08株则出现了与各对引物预期大小相符的条带。同时进行了灵敏性分析，结果显示可扩增到浓度为5．07x10母Itg／ml的模板。说明该方法具有较高的灵敏性与特异性，通过一次PCR反应可鉴别所感染的病毒属于GCRV或GCRV_GDl08株，该方法适用于生产上大批量草鱼样品的检测，可在短时间内确定感染病毒的分子特性，以便采取相应的防控措施。3．

3、GCRV-GDl08M6基因的克隆、抗原性分析及重组蛋白制备本研究克隆GCRV-GDl08的M6节段。M6基因全长2028bp，含一个开放阅读框(ORF)1716bp。M6基因的编码蛋白VP4与GenBank上已登录的GCRV标准株VP4序列同源性为47．4％。Blast分析显示lI上海海洋火学硕士学位论文VP4蛋白具有ReovimsM2超家族的主要结构域(ReovirusmajorvirionstructuralproteinMu-1／Mu一1C(M2)superfamily)，该蛋白家族在病毒的结构和功能的行使

4、上起重要作用，是病毒的外衣壳蛋白，在病毒的膜穿透过程中起作用，推测GCRV-GDl08VP4具有相似的功能。用DNAstar软件预测M6抗原区，显示其具有28个抗原表位，提示VP4具有较强的抗原性。本研究进一步采用基因工程技术制备重组重组VP4蛋白。根据M6的ORF序列设计引物，将VP4编码序列克隆至表达载体中构建重组原核表达载体pET32a．VP4，转化至大肠杆菌BL21(DE3)，经诱导可表达分子量大小为87kDa的His．VP4融合蛋白。本研究为下一步开展GCRV-108的致病性和感染机制研究，并有效防止草鱼

5、出血病爆发奠定基础。4．重组蛋白免疫原性与保护作用评价重组蛋白经镍柱纯化后免疫兔制备多克隆抗体，经Elisa检测，抗体效价达到l：64000以上，说明重组蛋白VP4具有较好的免疫原性。用此重组蛋白免疫草鱼，受免鱼免疫14d后进行人工攻毒，结果表明重组VP4蛋白对病毒感染有较好的保护效果，31xg／g注射量的保护率可达到82％。关键词：草鱼呼肠孤病毒，双重PCR，分析，VP4蛋白，抗原性，基因工程，疫苗III上海海洋大学硕士学位论文MolecularcharacterizationofGCRVinSouthernCh

6、inaandimmuneeffectoftheVP4recombinantproteinAbstractGrasscarp(Ctenopharyngodonidellus)isakindofimportantfreshwateraquaculturespeciesinChina，Productionaccountsforabout20％ofthetotalfreshwatercultured．ItisofimportantsignificanceinChina’Sagriculturaleconomy．Hemorr

7、hagecausehighermortality,creategreatlosstograsscarpbreeding．AstrainofgrasscarpreovirusnamedGCRV-GD108wasisolatedfromsickenedgrasscarpwithsymptomsofhaemorrhageinGuangdongprovince．CompletegenomesequenceanalysisshowedthatsignificantdifferencesexistedbetweenGCRV-G

8、D108andGCRV,aswellasotherknownspeciesofAquareovirus．Inthisstudy,molecularcharacteristicsofdiseasedgrasscarpcollectedfromdifferentfarmswereassayed．Twopairsofprimerswerechosentoestab