hps自转运蛋白免疫原性及其和宿主细胞相互作用的研究

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1、HPS自转运蛋白的免疫原性及其与宿主细胞相互作用研究摘要副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis)作为猪上呼吸道的一种常在菌，在特定条件下可以侵入机体引起全身性疾病。近年来，该病给全球养猪业造成巨大经济损失，同时也引起了研究者的关注。目前，虽然有大量针对副猪嗜血杆菌的研究报道，寻找出许多毒力候选基因，但我们对副猪嗜血杆菌致病机制的了解还十分有限。革兰氏阴性细菌V型蛋白分泌系统，也称为自转运蛋白。该蛋白主要由3部分组成，包括信号肽，N端的passenger结构域(passengerdomain)和C端的p结构域(13domain)

2、，其中passenger结构域是其发挥功能的部分。研究表明，该蛋白与细菌的粘附、入侵、细胞毒性有关，可介导生物被膜的形成和血清抗性的产生，因此被认为是病原微生物的一种重要的毒力因子。为探究自转运蛋白在副猪嗜血杆菌的致病过程中可能起到的作用，本论文将副猪嗜血杆菌SH0165菌株中发现的两个自转运蛋白基因at2和at3作为研究对象，运用PCR、原核表达、单克隆抗体、蛋白免疫印迹等技术开展研究。主要研究结果如下：1．at2、at3，at2．passengerdomain(at2一pcO和扔一passengerdomain(atS-pd)的克隆及相

3、应蛋白的原核表达以SH0165菌株的基因组DNA为模板，PCR扩增at2、at3，at2-pd和at3-pd，四个片段大小分别为2336bp、2443bp、1368bp和1392bp，分别编码771、780、450和458个氨基酸。将at2、at3分别与pET．30a连接，at2-pd、at3-pd分别与pET-28a连接，连接产物转化E．coli／DH5a菌株，将测序正确的质粒再转化E．coli／BL21(DE3)菌株并进行原核表达。结果成功克隆了上述4个片段并构建了其相应的原核表达载体，在E．coli／BL21(DE3)菌株中实现了上述

4、4种蛋白的原核表达，分别命名为AT2、AT3、AT2．PD和AT3．PD。2．AT2．PD和AT3一PD蛋白的纯化及其单克隆抗体的制备在E．coli／BL21(DE3)菌株中表达的AT2．PD和AT3。PD蛋白以可溶性的形式存在，利用蛋白融合表达的组氨酸标签对蛋白进行纯化。使用纯化的蛋白免疫BALB／c鼠进行单克隆抗体的制备工作。结果AT2．PD蛋白获得5株能产生单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为1E4、3C9、3D8、3E8和4810；AT3．PD蛋白获得5株能产生单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为2E6、3H8、4C8、4F12和4

5、H10。间接ELISA和Western．blot分析表明抗体特异性良好，其中4810的效价为1：102400：4H10的效价为1：25600，这两份单克隆抗体用于后续实验的开展。华中农业大学2011届硕士研究生学位论文3．AT2和AT3蛋白在E．coli／BL21(DE3)和SH0165上的定位分析利用获得的单克隆抗体结合Western-blot实验分析AT2和AT3蛋白分别在E．coli／BL21(DE3)．AT和SH0165上的定位情况。分别提取这两种细菌的细胞总蛋白，细胞膜总蛋白和分泌蛋白。结果显示，AT2和AT3蛋白分别存在于表达该

6、蛋白的E．coli／BL21(DE3)菌株的细胞总蛋白，细胞膜总蛋白和分泌蛋白中；AT2蛋白存在于SH0165的细胞总蛋白和细胞膜总蛋白中；AT3蛋白存在于SH0165的细胞总蛋白、细胞膜总蛋白和分泌蛋白中。4．AT2和AT3蛋白的免疫原性分析由于AT2和AT3蛋白在SH0165是细胞膜蛋白和／或分泌蛋白，故对其免疫原性进行分析。首先检测其在15株HPS标准血清型菌株中的分布情况，实验表明口垃基因除在标准血清型4型菌株中未扩增出相应条带外，其余均可扩增出相应条带；at3基因在所有标准血清型菌株中均可扩增出相应条带。利用纯化的AT2．PD和A

7、T3．PD蛋白作为抗原包被酶标板，使用7份不同血清型菌株攻毒猪后获得的感染血清进行间接ELISA实验，．结果显示为阳性；同时利用Western-blot对该7份血清中针对AT2．PD和AT3．PD的抗体也进行了检测，结果也显示为阳性。5．AT2和AT3蛋白分别与细胞相互作用使用分别表达AT2和AT3蛋白的E．coli／BL21(DE3)菌株分别与猪髋动脉内皮细胞、猪肺细胞、猪气管上皮原代细胞进行粘附与粘附阻遏实验，结果显示这两种细菌与上述3种细胞均无明显的粘附作用。分别使用纯化的AT2一PD和AT3．PD蛋白与上述3种细胞进行结合实验，通过

8、间接免疫荧光观察，表明这两种蛋白均能分别结合到这3种细胞表面。综合以上研究内容的结果，我们认为这两个自转运蛋白属于分泌型蛋白，并具有良好的免疫原性。这两种蛋白能够结合多种体外培养