轮状病毒与宿主细胞相互作用的研究

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1、第三军医大学博士学位论文轮状病毒与宿主细胞相互作用的研究姓名：何海洋申请学位级别：博士专业：免疫学指导教师：吴玉章201205第三军医大学博士学位论文轮状病毒与宿主细胞相互作用的研究摘要轮状病毒(Rotavirus，RV)属于呼肠孤病毒属，是一种无包膜的二十面体形状病毒。RV衣壳由三层同心包裹的结构蛋白构成，核心含有一个由11个双链RNA片段构成的基因组，后者编码12个病毒蛋白，包括6个结构蛋白(VPl—4，6，7)和6个非结构蛋白(NSPl．6)。轮状病毒具有严格的细胞嗜性，只能有效感染胃肠道

2、上皮及。肾上皮细胞。人和动物的婴幼个体对轮状病毒普遍易感。然而，随着年龄的增大，他们对RV的易感性也显著降低。产生这种变化的原因可能是在个体的生长过程中，针对RV的某些宿主限制性细胞因子出现了表达。目前许多研究表明一些宿主蛋白例如APOBEC3G、Lvl、Refl及EWI．2wint具有明显的抑制病毒感染的作用，而这些宿主限制性因子的表达可增加宿主对病毒的抵抗能力，降低宿主的易感性。然而，在RV感染中，类似的具有抑制RV感染的宿主蛋白却少有发现。如同在其它很多的病毒感染，在RV感染中，宿主蛋白的

3、合成受到了广泛的抑制。但是有研究发现，～些宿主蛋白如整合素02131、p2及伴侣蛋白Grp78、Grp94在RV感染过程中表达上调，并在RV的复制过程中发挥重要作用。这些结果表明RV能够选择性促进某些宿主蛋白的表达以保证病毒感染的顺利进行。相反，宿主细胞是否同样可以通过上调一些抗RV的宿主蛋白的表达以抑制RV的感染呢?RV感染是导致全球范围内5岁以下婴幼儿急性脱水腹泻的主要原因。RV腹泻发生的确切的分子机制到目前为止仍然没有定论。最初RV腹泻被认为是由于小肠绒毛顶部肠上皮细胞被RV感染后生理功能

4、受到破坏引起的。一些体外实验研究表明RV感染可以引起肠上皮细胞的凋亡和坏死。在对RV腹泻动物模型的研究中进一步发现RV感染可以导致小肠粘膜发生病理改变及功能异常，其程度的轻重取决于RV病毒株的毒力。然而，这种机制难以解释为什么在RV腹泻中常常发现肠道粘膜只有轻微的组织病理学改变且没有肠上皮细胞的破坏的现象。其它一些研究发现，RV感染后肠上皮细胞刷状缘相关的一些酶如蔗糖酶异麦芽糖酶(SI)、乳糖酶．根皮苷水解酶，二肽基肽酶Ⅳ(DPPⅣ)、Na+一D一葡萄糖转运体1(SGLTl)以及Na+L．丙氨酸

5、转运体的表达及活性的出现损害，由此推测RV感染导致肠上皮细胞对葡萄糖和氨基酸的消化吸收能力减弱可能是RV感染引起腹泻发生的一种可能的机制。但是这些研究都未能给出一个被广泛接受的RV感染引起腹泻发生的具体的分子机制。第三军医大学博士学位论文近年来，蛋白质组技术被广泛应用于病毒感染的研究之中，这对揭示病毒感染的病理生理机制，深化我们对病毒一宿主相互作用的认识发挥了巨大作用。在本研究中，我们通过蛋白质组技术来发现新的RV宿主限制性因子以及探究RV腹泻的新机制。本研究分为两部分，第一部分采用二维凝胶电泳

6、(2．DE)等技术发现新的RV宿主限制因子，观察宿主细胞的天然免疫机制是如何应对RV感染的；第二部分则运用一种先进的定量蛋白质组技术SILAC来研究RV感染肠上皮细胞引发腹泻的分子机制，观察RV是如何破坏宿主的天然免疫屏障从而致病的。本研究将会加深对RV感染及RV与宿主细胞相互作用分子机制的认识，为RV腹泻的预防和治疗提供实验依据。第一部分：新的RV宿主限制性因子发现首先，我们确定了RV感染的合适时间和MOI以获得最好的感染效果和细胞活力，这对随后的二维凝胶电泳分析十分重要。为进行二维凝胶电泳样

7、本的制备，我们将MAl04培养在直径10cm的组织培养皿中，当细胞完全汇合时，用用纯化的人轮状病毒Wa株感染(moi=3)，同时用等量的DMEM作为对照感染。细胞感染12后用冷O．9％NaCl冲洗感染的细胞，蛋白裂解液提取细胞总蛋白。采用13emReadyStripIPG胶条(非线性，pI3．10)在IPGphor电泳系统上进行蛋白质的等电聚焦。等电聚焦结束后，将胶条置于预先制好的12．5％聚丙烯酰胺凝胶上垂直电泳以进行多肽分离。电泳结束后，用胶体蓝对凝胶进行染色，并采用GS800扫描仪对染色后

8、的凝胶进行扫描，用PDQuest6．1软件进行图像分析。我们选择RV感染后表达显著上调50％以上的蛋白点，通过MALDI．TOF．MS进行蛋白序列鉴定。结果显示在人RVWa株感染的MAl04细胞中共发现24个蛋白点的表达显著上调50％以上，质谱成功鉴定了其中16个蛋白点。在成功鉴定的蛋白点中，11个为宿主蛋白(10种)，5个点为病毒蛋白(4种)。我们随机选取了一些宿主蛋白如ACPl、ALDOA、CYPA和KRT20对它们的表达采用Westernblot和qRT．PCR等方法进一步验证。其次，为了