猪链球菌与宿主细胞的相互作用以及毒力相关蛋白hp0197的功能研究

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1、华中农业大学博士学位论文猪链球菌与宿主细胞的相互作用以及毒力相关蛋白HP0197的功能研究姓名：陈博申请学位级别：博士专业：预防兽医学指导教师：金梅林201206猪链球菌与宿主细胞的相互作用以及毒力相关蛋白的功能研究摘要猪链球菌(Streptococcussuis，&suis)是一种重要的细菌性猪病病原，其常给全球的养猪业造成巨大损失。当感染Ssuis后，病猪通常会出现脑膜炎，关节炎，心内膜炎，以及败血症等症状。该菌按照血清型的不同，可分为33个血清型(1型．31型，33型和1／2型)，其中猪链球菌血清型2型(Streptococcussuisserotype2，SS2)在世界

2、范围内被广泛报道为最主要的致病性血清型。另外，Ssuis也是一种重要的人畜共患病病原。从丹麦的第一例人感染猪链球菌病例开始，Ssuis已经在全球至少20个国家造成超过700人感染。尽管猪链球菌已在全球引起了高度的关注，然而当前对其致病机理的研究还很有限。病原菌粘附到宿主细胞或组织表面以及其随后的侵入与扩散过程是病原菌致病的关键步骤。并且病原菌与宿主之间的相互作用参与着所有这些过程。因此，研究病原菌的致病机理也就是研究病原菌与宿主的相互作用过程。本研究试图以一些Ssuis的表面毒力相关蛋白为诱饵，通过鉴定该蛋白与宿主细胞之间的相互作用，为解释其生物学功能与致病机理提供理论依据；另

3、一方面，能够与宿主细胞发生相互作用的细菌表面蛋白大多参与着细菌的致病过程。因此，本研究希望能够通过大规模系统的方法将这部分蛋白鉴定出来，其将为进一步的研究病原菌的致病机理提供研究基础；病原菌的毒力相关蛋白通常也是其重要的保护性抗原，因此本研究所鉴定的细菌表面蛋白极有可能被开发成为疫苗候选的分子，为解决猪链球菌病得防控提供帮助，而本研究也尝试去评价这部分蛋白的保护效力。现将主要研究结果报告如下：1．猪链球菌保护性抗原HP0197与宿主细胞之间的相互作用的研究在本研究前期的工作当中，HP0197蛋白己被鉴定为SS2新型的保护性表面抗原和毒力相关蛋白。然而该蛋白的生物学功能尚不清楚，

4、其在致病过程中的作用还有待于进一步证实。在本研究中，我们试图通过鉴定HP0197与宿主细胞的相互作用过程，进而为阐明该蛋白的生物学功能提供理论依据。首先，我们通过间接免疫荧光实验证实THP0197能够与Hep．2细胞发生相互作用。进一步实验显示，这种相互作用可以被肝素和胰酶完全阻断，其暗示着宿主细胞表面的类肝素的分子是HP0197的细胞受体。另外，HP0197还被发现能够与葡萄糖相结合，因此HP0197可能参与着Ssuis的能量代谢。为了证实这个推测，我们比较-：Ahp0197菌株和亲本株在不同培养时期的t-IPr蛋白的生物学活性。结果显示：当hp0197基因缺失后，菌株体内的

5、HPr蛋白的磷酸化随之改变，因此能够进而影响碳代谢调节基因CcpA的功能。2．鉴定猪链球菌2型表面蛋白与宿主细胞表面分子之间的相互作用病原菌与宿主蛋白质之间的相互作用参与着病原菌所有的感染过程。研究病原华中农业大学博士研究生学位论文菌与宿主之间的相互作用能够我们全面理解细菌病的致病机理。尽管目前这个领域已有少量的研究，但仍有待于全面的系统鉴定病原菌与宿主之间的蛋白质相互作用过程。在本研究中，我们建立了一种名为基于亲和层析的表面蛋白质组学(AffinityChromatography．basedSurfaceProteomics；ACSP)的新研究方法，该方法将亲和层析技术和sh

6、otgun蛋白质组学技术(LC．MS／MS)相结合，可以用来大尺度系统的研究病原与宿主之间的相互作用。为了完成ACSP实验，我们以锚定了天然的Hep一2细胞表面分子的树脂为诱饵，用来从Ssuis表面蛋白中捕获潜在的互作分子。随后，我们利用LC．MS／MS技术从捕获物中鉴定出40个潜在的表面互作蛋白，这些蛋白中有3个蛋白己在前期的研究中被证实。我们选取了8个重要的表面互作蛋白，并证实了其与Hep．2细胞的粘附作用。另外，3个新鉴定的表面互作蛋白的重组蛋白以及多克隆抗体能够显著的抑制&suis与Hep．2细胞的粘附过程，因此这3个蛋白极有可能在＆suis与Hep．2细胞的相互作用过

7、程中发挥着重要的作用。通过使用这个例子，我们证实了ACSP技术是一个非常有价值的研究病原菌与宿主相互作用的实验工具。3．猪链球菌免疫原性蛋白HP0272的保护力评价Ssuis是一个重要的猪细菌病病原，其同时也是一个人畜共患病病原。开发新的有效疫苗能够帮助我们控锘aJs．suis的感染。HP0272是一个细菌表面免疫原性表面蛋白，其保护效力有待进一步的评价。在本研究的小鼠模型当中，纯化的重组HP0272能够诱导显著的抗体水平，并保护小鼠以抵抗致死剂量的SS2人工感染。另外，实时荧光定量PCR也