布鲁氏菌疫苗株流产相关因子omp25蛋白和宿主胚胎滋养细胞相互作用的研究

布鲁氏菌疫苗株流产相关因子omp25蛋白和宿主胚胎滋养细胞相互作用的研究

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时间:2019-02-01

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1、布鲁氏菌疫苗株流产相关因子Omp25蛋白与宿主胚胎滋养细胞相互作用的研究中文摘要布鲁氏菌病(brucellosis)(以下简称布病)是由布鲁氏菌(brucella)引起的人、畜共患传染病,广泛分布于世界各地。布鲁氏菌病对我国经济建设、人民健康生活、国家安全等存在着严重的威胁。布病的病原为布鲁氏菌,是一种胞内寄生菌。它的致病机制以胞内生存为主要特征。研究表明,动物胎盘是布鲁氏菌生存、繁殖的嗜好区域之一。胚胎滋养层细胞是布鲁氏菌感染的靶细胞,一旦被破坏,容易引起流产,但是其分子机制目前还不清楚。因此,以布鲁氏菌和胚胎滋

2、养层细胞为研究对象具有重要意义。本研究主要包括以下几方面内容:⑴.流产布鲁氏菌S19omp25基因Bait载体的构建及鉴定。通过对流产布鲁氏菌S19omp25基因进行克隆、连接、酶切、纯化等实验,构建重组质粒pGBKT7-omp25并将其转化到酿酒酵母Y187中,通过酵母自激活实验和毒性实验检测转化子酿酒酵母Y187(pGBKT7-omp25)的构建。经PCR、酶切、测序表明成功构建了pGBKT7-omp25真核表达载体,获得的转化子酵母Y187菌株无自激活活性,无毒性。⑵.流产布鲁氏菌S19侵染TGC细胞后提取总

3、RNA构建cDNA文库。首先用布鲁氏菌S19侵染牛胚胎滋养层细胞(TGC)3.5h后提取TotalRNA,用试剂盒逆转录形成cDNA,采用同源重组技术构建布鲁氏菌S19侵染TGC细胞的cDNA文库,即6pGADT7-cDNA并将其转化到酿酒酵母AH109中,经鉴定,cDNA文库库容为1.30×10,重组效率为96.0%,插入片段大小在0.2-2.0kb之间。⑶.酵母双杂交实验。应用酵母双杂交技术,将酿酒酵母AH109(pGADT7-cDNA)和Y187(pGBKT7-omp25)进行杂交并将阳性杂交子进行摇菌、提质

4、粒、转化DH5α、PCR等实验鉴定。最后送交测序并对测序结果进行分析。测序结果表明,筛选出与流产布鲁氏菌流产相关因子Omp25相互作用的TGC细胞的靶蛋白共16个。⑷.Q-RT-PCR实验。通过上述实验获得16个蛋白基因序列,对其中2个基因设计引物,检测两种特异结合蛋白的mRNA的增减规律,进一步分析与S19、RB51的Omp25蛋白相互作用的滋养层细胞靶蛋白。结果表明RB51侵染TGC细胞后,TMED1和clusterin基因的量均增加,而S19侵染TGC细胞后,TMED1基因增加,clusterin基因的量降低

5、。以上实验结果证明,成功地构建了流产布鲁氏菌S19omp25基因Bait载体;成功构建了流产布鲁氏菌S19侵染TGC细胞的cDNA文库;酵母双杂交筛选出流产布鲁氏菌OMP25蛋白与TGC细胞相互作用的16个蛋白,并对TMED1基因和clusterin基因进行Q-RT-PCR分析。通过本实验,为揭示流产布鲁氏菌感染与母畜流产间的分子机制奠定基础。关键词:流产布鲁氏菌;Omp25;外膜蛋白;酵母双杂交;cDNA文库-8-布鲁氏菌疫苗株流产相关因子Omp25蛋白与宿主胚胎滋养细胞相互作用的研究AbstractBrucel

6、losis,whichisazoonosischronicinfectiondiseasecausedbyBrucella,hasoccuerdwidlyintheworld.Brucellosisisaseverethreatentheeconomyconstruction,publichealthandthenationalsecuritytoourcourtry.Brucellaspp.isthepathogenofbrucellosis.Brucellaearefacultativeintracellula

7、r.ResearchonThevirulenceofBrucelladependsuponitsabilitytosurviveandreplicateinhostcells.Animalplacentaisoneofthemostfavoritelocationsofsurvivingandreplicating.Embryonictrophoblastisthetargetcellsofbrucella.Oncedestroyed,itwillinduceabortion.However,itsmolecula

8、rmechanismofabortionisunclear.Therefore,wewillbaseonBrucellaandEmbryonictrophoblastcellsinthisstudy,themaintasksincludeasthefollowingparts:⑴.Constructionandidentificationofbaitvect

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