与膜联蛋白a7相互作用蛋白以及细胞自噬和凋亡诱导剂的筛选、鉴定及其作用机制研究

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1、山东大学博士学位论文与膜联蛋白A7相互作用蛋白以及细胞自噬和凋亡诱导剂的筛选、鉴定及其作用机制研究研究背景和目的中文摘要白噬是细胞内组分包括蛋白质、脂质、糖类、核苷酸、细胞器及入侵的病原体被运送到溶酶体降解的过程。降解产物可以被细胞重新用于营养循环或细胞器更新，因此自噬对于维持细胞内稳态和能量代谢平衡非常重要。自噬可被多种因素诱导，例如营养或生长因子缺乏、低氧、活性氧、DNA损伤、受损细胞器及病原体入侵等，此时，自噬主要起保护性的作用使机体适应环境变化。自噬失调会导致重大疾病发生，包括心血管疾病、神经退行性病变、肿瘤、动

2、脉粥样硬化和老化等。因此，研究自噬的分子机制具有极为重要的病理、生理学意义。血管内皮细胞是覆盖于血管内膜表面的单层细胞，在保护内膜完整性及维持血液流动和稳态方面起着关键的作用。内皮功能的失调会引发多种疾病如高血压、动脉硬化、高血糖症等。自噬和血管内皮功能的失调都会导致疾病。因此，近年来自噬的功能以及自噬对正常内皮细胞功能的调节成为研究热点。在前期研究中，我们发现化学小分子ABO可以诱导正常培养条件下血管内皮细胞自噬，并可以抑制去血清去生长因子诱导的内皮细胞凋亡。进一步研究发现膜联蛋白A7(ANXA7，AnnexinA7，

3、synexin)通过对钙离子的调控在ABO诱导的内皮细胞自噬中发挥关键的作用。ANXA7是钙离子依赖的磷脂结合蛋白．Annexins家族成员之一，具有形成钙离子通道及调节胞内钙离子稳态的功能。并且我们的前期数据表明ANXA7介导的细胞自噬信号通路与经典的mTOR、ROS介导的信号通路不同，表明ANXA7介导着新的细胞自噬信号通路，但是其下游因子尚未知。ANXA7在诱导血管内皮细胞自噬中发挥重要的作用，然而其调节内皮细胞的自噬机理尚不清楚。为此，本研究利用酵母双杂交系统筛选和鉴定了与ANXA7相互作用的蛋白，并研究其相互作

4、用与调节血管内皮细胞自噬之间的关系，这山东大学博士学位论文为阐明血管内皮细胞自噬的分子机制提供实验证据。具有调节细胞或蛋白功能及生物学过程的化学小分子是研究细胞信号通路和疾病机理的良好工具，同时可为开发治疗相关疾病的药物奠定基础。另外，细胞自噬和凋亡之间关联密切，但是其关联机制仍未知。因此，本研究第二部分内容为筛选和鉴定能够调节肺癌细胞自噬与凋亡的化学小分子，目的是为深入研究肺癌细胞自噬和凋亡及其关联的复杂机理提供新的工具和切入点，同时为开发新的治疗肺癌的药物提供新先导化合物。研究内容1．利用酵母双杂交系统筛选并鉴定与A

5、NXA7相互作用的蛋白(1)构建诱饵蛋白表达载体NpGBKT7．ANXA7(2)检测诱饵蛋白对酵母细胞AHl09的毒性及白激活效应(3)筛选人肝脏cDNA文库(4)生物信息学分析阳性文库质粒，并在血管内皮细胞内验证候选蛋白与、ANXA7的相互作用2．筛选出与ANXA7相互作用的粒钙蛋白，并研究其在化学小分子ABO诱导血管内皮细胞自噬中的调控作用。(1)ABO对粒钙蛋白和ANXA7相互作用的影响(2)ABO对粒钙蛋白在血管内皮细胞分布的影响(3)抑制粒钙蛋白的表达对ABO诱导的血管内皮细胞自噬的影响(4)粒钙蛋白和ANXA

6、7的相互作用对血管内皮细胞钙离子的影响3．利用肺癌细胞筛选能够诱导细胞自噬与凋亡的化学小分子，为研究自噬或凋亡的细胞信号通路提供工具，为开发相关治疗疾病的药物奠定基础。(1)小分子化合物对P53野生型A549细胞生长及作用机制研究(2)小分子化合物对P53突变型H322细胞生长及作用机制研究(3)小分子化合物对P53缺失型H1299细胞生长及作用机制研究(4)小分子化合物对正常胚肺细胞生长作用的影响山东大学博士学位论文研究方法I．利用酵母双杂交系统筛选鉴定与ANXA7相互作用的蛋白并研究其在血管内皮细胞自噬中的作用1．诱

7、饵表达载'tzENpOBKT7．ANXA7构建：以pCMV6．XL5．ANXA7质粒为扩增ANXA7基因序列的模板，使用引物ANXA7．F／R引入特异性的酶切位点。PCR产物双酶切后连接入酵母表达载'f习kNpGBKT7qa。2．检测诱饵蛋白对酵母细胞的毒性和自激活效应：根据Clontech公司操作手册，将诱饵质粒NpGBKT7．ANXA7和空载体NpGBKT7分别转入酵母感受态细胞AHl09，根据转化两种质粒的酵母在固体SD／．Trp缺陷培养基的生长表型，以及在液体SD／．Trp缺陷培养基中的菌体密度判断诱饵蛋白对酵母

8、细胞的毒性。将NpGBKT7．ANXA7和pGADT7快速共转入酵母AHl09，通过酵母在不同3．AT浓度的SD／．Trp／．Leu／．His平板上的长势判断诱饵蛋白有无自激活效应。3．筛选eDNA文库：根据操作手册将人肝脏eDNA文库转化携带诱饵质粒的酵母感受态细胞，取100山梯度稀释的细胞悬液，分别涂布于q)9c