大豆GmWRKYs基因的克隆和功能研究

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学校代码：10564学号：2013200214分类号：S565.1密级：硕士学位论文大豆GmWRKYs基因的克隆和功能研究彭俊楚田江研究员指导教师：梁翠月副研究员学院名称：农学院专业名称：植物学答辩委员会主席：王秀荣研究员中国·广州2016年6月 华南农业大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。本人签名：日期：导师签名：日期： 摘要低磷和铝毒害是限制南方酸性土壤大豆生产的重要因子。植物WRKY转录因子是数量众多功能重要的转录因子家族之一，在调控植物适应逆境胁迫中起着重要作用。大豆基因组中含有至少127个WRKY家族成员，本研究通过生物信息学分析，筛选四个IIa型WRKY基因，并对其亚细胞定位、转录激活活性以及表达模式等性质进行了分析。根据所得结果，筛选出受低磷和铝毒共同调控的GmWRKY7进行初步的功能分析。主要结果如下：1）通过比对在大豆基因组中获得四个与拟南芥AtWRKY40高度同源的GmWRKY基因。根据这些基因在基因组上的位置，分别将其命名为GmWKRY7，GmWRKY8，GmWRKY13和GmWRKY15。这四个GmWRKY蛋白的N端均含有一个典型的WRKY结构，均属于IIa型WRKY转录因子。2）酵母单杂结果显示，这四个GmWRKY蛋白均无转录激活活性。进一步亚细胞定位结果显示，四个GmWRKY的亚细胞定位不同。其中GmWRKY7和GmWKRY8定位于细胞核；GmWRKY13定位于细胞核和质体；而GmWRKY15定位在质体内。3）对这些GmWKRY基因的表达模式分析结果显示，营养元素的缺乏对这四个基因在植株不同部位的表达均有不同程度的调控。其中，缺磷和缺铁上调了这四个GmWKRY在叶片和根系的表达水平。缺氮和缺硫均上调了这四个GmWKRY基因在叶片的表达量。但在根系中，缺氮上调了GmWKRY7和GmWRKY15的表达量，抑制了GmWRKY8的表达。缺硫则抑制了GmWKRY7和GmWRKY8的表达，对GmWRKY15的表达量无明显影响。缺钾除了抑制GmWRKY15在老叶的表达以外，均上调了各基因在各部位的表达。缺钙抑制了这四个基因在新叶以及GmWRKY15在老叶的表达，但提高了GmWKRY7和GmWRKY8在老叶和根系的表达，对于GmWRKY15在根系的表达量则无显著影响。4）激素调控了GmWKRYs基因的表达。其中，GA3、ABA和IAA能够瞬时提高GmWRKY7的表达水平；KT则瞬时抑制该基因的表达。GmWRKY8的表达水平在GA3和IAA处理条件下瞬时上调，但在6-BA和KT处理条件下受到明显抑制。另外，除ABA瞬时上调，6-BA和KT抑制GmWRKY15的表达水平以外，其他激素对该基因的表达无明显影响。5）铝处理能明显提高大豆根尖GmWRKY7，GmWRKY8和GmWRKY15的表达。I 与铝敏感基因型相比，耐铝基因型品种中铝调控的GmWRKY7的相对表达量较高，而铝调控的GmWRKY8和GmWRKY15的相对表达量较高。6）选取GmWRKY7进行下一步功能分析。酵母单杂分析结果显示GmWRKY7能够结合GmALMT1的启动子区域。在拟南芥中超量表达GmWRKY7，能够显著降低低磷胁迫下转基因拟南芥花青素的积累。综上所述本文研究系统分析了大豆四个IIa型GmWRKY转录因子的亚细胞定位，转录激活活性以及其编码基因的表达模式等特性，并初步分析了GmWRKY7在大豆适应铝毒和低磷胁迫中的生物学功能，为今后深入研究大豆GmWRKY转录因子的功能提供了有用信息。关键词：酸性土壤；低磷胁迫；铝毒；GmWRKY；大豆II IsolationandfunctionanalysisofsoybeanGmWRKYsPengJunchu(DepartmentofPlantNutrition,CollegeofAgriculture,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou510642,China)Abstract：LowphosphorusandaluminumtoxicityareprimaryfactorslimitingsoybeanproductiononacidicsoilsofsouthChina.WRKYtranscriptionfactorsareoneofthelargestfamilyoftranscriptionalregulatorsfoundinplants.Theyhavediversebiologicalfunctionsespeciallyinplantabioticstressresponses.Thereareatleast127membersofWRKYfamilyinsoybean.Inthepresentstudy,weselectfourWRKYgenesbelongstogroupIIabybioinformaticsanalyzed.Thenweanalysisthesubcellularlocolization,transcriptionalactivationandrelativeexpressionofthesefourWRKYs.Accordingtotheresults,wefurtheranalyzedthefunctionofGmWRKY7inresponsetoaluminumtoxicityandlowphosphorus.Mainresultsareshowedbelow:1)ThroughthehomeodomainanalysisofGmWRKYwithAtWRKY40,weselectfourGmWRKYgenesnamedbythepositionoftheirchromosome,GmWRKY7,GmWRKY8,GmWRKY13andGmWRKY15respectively.ThesefourWRKYproteinscontainadomaincomposedoftheconservedWRKYconstructintheirN-terminal,andbelongtogroupIIaofWRKYfamily.2)ResultsoftranscriptionalactivationanalysisshowedthatthesefourGmWRKYshavenotranscriptionalactivation.FurthertheresultsshowedthatsubcellularlocolizationofthesefourWRKYsareindifferentposition.GmWRKY7andGmWRKY8locatedinnuclear;GmWRKY13locatedinnuclearandplasmid;GmWRKY15onlylocatedinplasmid.3)ResultsoftherelativeexpressionoftheseGmWRKYsindicatethatexpressionofthesefourgenesindifferentorganregulatedbynutrientdeficiency.ExpressionofGmWRKYsinrootandleaveswasinducedbyPdeficiencyandFedeficiency.Howeverinroot,expressionofGmWRKY7andGmWRKY15wasinducedbyNdeficiencyaswellasGmWRKY8wasreduced.ExpressionofGmWRKY7andGmWRKY8wassignificantreducedandexpressionofGmWRKY15wasnotinfluencebySdeficiency.ExpressionofIII GmWRKY15inoldleaveswasrepressedandinducedinotherpartsunderKdeficiency.ExpressionofthesethreegenesyoungleavesandexpressionofGmWRKY15inoldleaveswererepressedunderCadeficiency,buttheexpressionofGmWRKY7andGmWRKY8wasinducedunderdeficiency,andexpressionofGmWRKY15hasnosignificantdifferenceinrootundertheCadeficiency.4)ExpressionofGmWRKYsalsoregulatedbyhormones.GmWRKY7wassignificantinducedbyGA3,ABAandIAAinashorttimetreatmentandrepressedunderKTtreatment.ExpressionofGmWRKY8wasinducedunderGA3andIAAtreatmentinashorttime,butwassignificantlyreducedunderthe6-BAandKTtreatment.Inaddition,expressionofGmWRKY15wasdepressedby6-BAandKTandwasinducedbyABAtreatment,nosignificantdifferenceunderotherhormonestreatment.5)ExpressionofGmWRKY7,GmWRKY8andGmWRKY15inroottipwassignificantlyinducedbyaluminumtreatment.TocomparewithAlsensitivegenotypes,therelativeexpressionofGmWRKY7washigher,howeverGmWRKY8andGmWRKY15hasoppositeresults.6)GmWRKY7wasselectedforfurtherfunctionanalysis.TheresultofyeastonehybridshowsthatGmWKRY7canbindingtothepromoterofGmALMT1.AndoverexpressionofGmWRKY7inArabidopsiscansignificantinducetheanthocyaninaccumulationinresponsetophosphorusdeficiency.Inconclusion,inthisresearch,throughthesubcellularlocalizationanalysis、transcriptionalactivationanalysisandtherelativeexpressionofthesefourIIatypeGmWRKYs,wewereanalyzedbiologicalfunctionofsoybeanGmWRKY7inresponsetoAltoxicityandlowp.FuthermorethisstudyalsoprovideusefulinformationsforfutureresearchofGmWRKYsinsoybean.Keyword:AcidsoilPdeficiencyAltoxicityGmWRKYSoybeanIV 英文缩略语及中文对照缩写符号英文名称中文名称bpBasepair碱基对cDNAcomplementaryDNA互补DNACTABHexadecyltrimethyl-十六烷基三甲基溴化铵ammoniumBromidedNTPsDeoxyribonucleosidetriphosphate脱氧核糖核苷三磷酸（4种）E.coliEschericiacoli大肠杆菌EDTADidodiumethylenediaminetetra-acetate乙二胺四乙酸LBLuriabrothLB培养基mgMilligram毫克μgMicrogram微克mLMillilitre毫升molMolar摩尔OXover-expression过量表达PCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应RNARibonucleicacid核糖核酸rpmRevolutionsperminute每分钟转速RTReversetranscription反转录RT-PCRReversetranscriptPCR反转录PCRSNPSinglenucleotidepolymorphism单核苷酸多态性μgMicrogram微克μLMicroliter微升μMMicromoleperliter微摩尔每升V 目录1前言....................................................................................................................................11.1植物适应低磷胁迫机制的研究进展.............................................................................11.2植物耐铝毒机制的研究进展.........................................................................................21.3WRKY转录因子家族调控植物适应低磷胁迫和铝毒害的研究进展.........................41.4本研究的目的和意义......................................................................................................62材料与方法........................................................................................................................72.1本研究总体技术路线......................................................................................................72.2实验材料..........................................................................................................................82.2.1植物材料.......................................................................................................................82.2.2载体和菌株...................................................................................................................82.2.3培养基及配方..............................................................................................................112.2.3.1细菌培养基...............................................................................................................112.2.3.3MS培养基................................................................................................................112.2.3.4瞬时表达所用培养基..............................................................................................122.2.4主要试剂及配制.........................................................................................................122.2.4.1抗生素和激素配方..................................................................................................122.2.4.2酵母转化配方..........................................................................................................132.2.4.3琼脂糖凝胶电泳.....................................................................................................132.2.4.5DNA抽提主要试剂................................................................................................132.2.4.6RNA抽提主要试剂.................................................................................................132.2.5主要药品和试剂.........................................................................................................142.3主要设备........................................................................................................................142.4实验方法........................................................................................................................152.4.1GmWRKY基因的克隆和生物信息学分析..............................................................152.4.2GmWRKY基因表达模式分析..................................................................................152.4.2.1营养元素缺乏对GmWRKY基因表达的影响......................................................152.4.2.2激素对大豆GmWRKY基因表达的影响..............................................................152.4.2.3铝毒害对GmWRKY基因表达的影响..................................................................16VI 2.4.3RNA的提取和反转录................................................................................................162.4.3.1植物组织基因组RNA的提取................................................................................162.4.3.2植物组织基因组RNA的反转录............................................................................162.4.4实时定量PCR及其引物设计...................................................................................172.4.5DNA的提取...............................................................................................................172.4.6GmWRKY基因的表达载体构建..............................................................................182.4.6.1GmWRKYs的Gateway系统的载体构建.............................................................182.4.6.2GmWRKYs的亚细胞定位载体pBEGFP构建.....................................................182.4.6.3GmWRKYs和GmALMT1启动子的酵母单杂载体构建....................................192.4.7大豆GmWRKY的亚细胞定位................................................................................192.4.7.1瞬时表达转洋葱表皮细胞......................................................................................192.4.7.2瞬时表达转烟草表皮细胞......................................................................................202.4.8拟南芥的转化与后代筛选.........................................................................................202.4.9拟南芥花青素含量测定.............................................................................................212.4.10数据统计及分析.......................................................................................................213结果与分析......................................................................................................................223.1大豆IIa型WRKY基因成员的生物信息学分析......................................................223.1.1大豆GmWRKY的进化树和结构域分析.................................................................223.2大豆GmWRKY基因家族成员的生物学特性分析...................................................253.2.1大豆GmWRKY的转录激活活性分析....................................................................253.2.2大豆GmWRKY的亚细胞定位分析........................................................................253.3大豆GmWRKYs基因表达模式分析...........................................................................273.3.1营养元素的缺乏对大豆GmWRKYs基因表达模式的影响....................................273.3.2部分激素处理对大豆GmWRKYs基因表达模式的影响.........................................293.3.3铝毒害对大豆GmWRKYs基因表达模式的影响...................................................313.3.3.1铝毒害调控大豆GmWRKYs基因的表达............................................................313.3.3.2铝调控的GmWRKYs表达的自然变异分析.........................................................323.4大豆GmWRKY7的功能研究.....................................................................................343.4.1大豆GmWRKY7与GmALMT1启动子相互作用的分析.......................................343.4.2GmALMT1与GmWRKY7响应铝毒害的表达模式分析..........................................36VII 3.4.2.2超量表达GmWRKY7对拟南芥响应低磷胁迫的影响..........................................364讨论与结论......................................................................................................................394.1大豆GmWRKY家族基因分析......................................................................................394.2大豆GmWRKYs的表达模式分析...............................................................................404.3GmWRKY与大豆铝毒适应性的关系.........................................................................414.4GmWRKY与大豆低磷适应性的关系.........................................................................414.5结论................................................................................................................................42致谢..............................................................................................................................44附录..............................................................................................................................51VIII 1前言大豆[Glycinemax（L.）Merr]是中国人餐桌上的佳肴，凭借其丰富的蛋白质和脂肪含量，是制作豆油和食品调料等的重要原料（王王王等，2001）。近年来随着市场的发展，我国的大豆难以自给，需要靠大量的进口才能满足国内市场的需求。中国粮油信息网最新的资料显示，2015至2016年度，中国的大豆进口量预计为8100万吨，大豆供应总量预计为1.06亿吨，远远超过中国预计产量1100万吨。所以，国内大豆的供需矛盾已经到达了新高点，提高国内大豆产量已经成为中国市场的一大诉求。虽然我国目前大部分的大豆产量都来自东北地区，但是在东北的大豆种植面积王续下滑（程程，）2013。在中国南方，气候温和湿润，且一年能够种植两季，在发展大豆生产上具有天然优势。但是，南方大部分土壤呈酸性，酸性土壤上存在多种限制作物生产的因素，其中铝毒和低磷胁迫显得尤为突出。因此，要实现南方大豆大面积的推广和生产，需进一步挖掘大豆协同适应酸性土壤低磷和铝毒害的遗传潜力，培育适应酸性土壤的大豆品种（李李李等，1995；严严严等，1997；张张张等，2008）1.1植物适应低磷胁迫机制的研究进展磷是植物生长的必需营养元素之一，在植物新陈代谢过程中非常重要，不仅在植物的光合作用、呼吸代谢、能量转化和信号转导生理过程中起着重要的作用，并且还是生物大分子合成和酶活性的调节等生化过程中其中不可或缺的基本单位（梁翠月和廖红，）2015。在酸性土壤上，磷会被大量的铁、铝、钙等离子所固定，所以酸性土壤中的有效磷含量有限，难以满足植物生长的正常需求（梁翠月和廖红，；2015Wangetal.,2010）。在低磷胁迫下，植物主要通过调控根构型以及增加根系分泌物，活化利用难溶性磷；同时，增强磷转运子基因的表达，提高磷的吸收效率；另外，与根际微生物形成共生体系也是提高磷效率的机制之一（梁翠月和廖红，；2015王保明等，2015；Wangetal.,2010；）。其中，根形态构型对低磷胁迫的响应主要通过多种激素以及一系列基因的表达调控来实现（Chiouetal.,2011；LiangCetal.,2014）。以模式植物拟南芥为例，低磷胁迫抑制了其主根的伸长，但促进了其侧根及根毛生长发育。研究表明，拟南芥多个调控因子包括LPI1、LPI2、PDR2、LPR1和SIZ1等都参与了调控低磷条件下主根的生长（Sánchez-Calderónetal.,2006;Chiouetal.,2011;Sánchez-CalderónLetal.,2005）。而激素信号途径和多个转录因子1 参与调控拟南芥的侧根和根毛生长对低磷的响应。其中包括生长素受体TIR1，AUX/IAA，ARF7/19，WRKY6和WRKY42等（Chiouetal.,2011）。除了形成良好的根形态构型以外，植物还通过上调磷转运子基因提高对外界有效磷的吸收利用。根据现已有的报道，在植物中主要负责根系吸收和转运磷的重要蛋白家族是磷转运蛋白Pht1家族。从模式植物拟南芥到各种常见作物如番茄、水稻以及大豆等中逐渐发现了Pht1家族，并大部分都在根部有表达（LiuCetal.,1998；Paszkowskietal.,2002；Nussaume,2011；Qinetal.,2012）。在拟南芥根系中共检测到8个Pht1家族，在根表皮和根毛细胞中表达量高的有AtPHT1;1、AtPHT1;2和AtPHT1;4等（）Nussaume,2011。不同植物中的Pht家族在低磷情况下的表达量都会升高，并会受到miRNA和转录因子PHR1等的调控形成植物体内响应低磷的响应调控网络（梁翠月等，2015）。在拟南芥和水稻中，都存在PHF1协助磷转运子在细胞内质网向细胞膜定位的过程的分子机制，因此植物中的低磷响应调控网络是一个通过转录因子和蛋白质水平的协同调控的网络（Chenetal.,2011；）Nussaume,2011。低磷胁迫下，会诱导植物地上部积累花青素。花青素是类黄酮化合物，其前体为苯丙氨酸，是植物在清除自由基和抗氧化的重要次生代谢物（胡可等，2010）。现有的研究对于植物的花青素合成途径中的合成酶有很深入的报道，其中主要包括查尔酮合成酶（chalconesynthase，CHS）、黄烷酮3-羟化酶（flavanone3-hydroxylase，F3H）、二羟基黄酮醇还原酶（dihydroflavonol4-reductase，DFR）、花色素苷合成酶（anthocyaninsynthase，ANS）以及类黄酮3-O-糖基转移酶（flavonoid3-O-glucosyl-transferase，UFGT）等（Kreuzaleretal.,1983；Martinetal.,1991；贾贾东等，2014）。虽然在花青素合成途径上的研究较多，但关于花青素合成过程中受到的转录调控的研究仍然较少，目前主要关注于MYB、bHLH以及WD40三类转录因子上（贾贾东等，2014）。1.2植物耐铝毒机制的研究进展铝是地球地壳中含量最高的金属元素，并且拥有多种离子形态，其中三价铝离子3+3+（Al）对植物最为有害（Maetal.,2003）。Al能够结合细胞壁中的果胶，导致细3+胞壁变硬，可塑性变差；其次，Al还可以与DNA结合，导致DNA双螺旋僵化，阻3+碍了DNA的复制，从而导致细胞周期紊乱；Al进入到细胞后，与多种酶结合并降3+低其活性，扰乱细胞内的代谢活动；另外，Al还能损害植物细胞的自我修复功能。2 3+而Al在微观上对细胞结构和功能的破坏，在宏观上均表现为植物根系生长受到抑制，进而导致作物产量明显降低（Kochianetal.,2004）。植物主要通过内部忍耐和外部排斥两种机制解铝毒（Kochianetal.,2004）。其中在质外体进行解铝毒的机制称之为外部排斥机制，而与之对应的在共质体内进行解铝毒的为内部忍耐机制。有机酸的合成和分泌在外部排斥机制和内部忍耐机制中都起到了至关重要的作用，也是近年来研究的热点。植物分泌的有机酸主要包括柠檬酸、苹果酸以及草酸等。（McCulleyetal.,2004）。在铝毒环境下，植物根系的主动或被动的方式释放大量有机酸，螯合根际的铝离子，减少由于铝离子进入细胞而导致的损害。因此，加强有机酸的分泌对于植物耐铝十分重要（）Nussaume,2011。有机酸的分泌主要由有机酸转运子介导。迄今，多个有机酸转运子的编码基因已被克隆，且人们对其转运功能也有了一定的了解。这些转运子基因包括了MATE（multidrugandtoxiccompoundextrusion）家族基因和ALMT（Aluminum-activatedMalaterTransporter）家族基因等（林郑和等，2009）。其中，Magalhaes等（2007）通过图位克隆的方法从高粱的基因组中分离得到柠檬酸转运子基因SbMATE。该柠檬酸转运子定位在细胞膜上。超量表达该转运子基因能够显著提高转基因拟南芥对铝毒的忍耐能力（Magalhaesetal.,2007）。同年，Furukawa等（2007）也在大麦中通过图位克隆得到了大麦的柠檬酸转运子HvAACT1。该柠檬酸转运子也定位在细胞膜上。超量表达该转运子基因能够显著提高烟草对铝毒的忍耐能力（Furukawaetal.,2007）。随后，在其他物种如拟南芥、玉米和黑麦等也发现了MATE的同源基因（Liuetal.,2009；Maronetal.,2010；Yokoshoetal.,2010）。其中，玉米的两个同源基因ZmMATE1和ZmMATE2在玉米耐铝机制中的作用方式不同。ZmMATE2虽然定位在玉米耐铝的QTL（qALT5）上，但与玉米的耐铝能力无明显相关性。相反，ZmMATE1的表达水平与玉米耐铝能力成正相关关系（Guimaraesetal.,2014）。除了MATE家族基因外，ALMT家族基因在植物耐铝毒机制中也起到了重要作用。第一个ALMT基因是Sasaki等（2004）利用其抑制差减杂交技术，在严麦中克隆得到的TaALMT1基因（Sasakietal.,2004）。该基因在耐铝严麦品种ET8的表达量明显高于铝敏感品种ES8（Sasakietal.,2004）。在烟草悬浮细胞、爪蟾卵母细胞以及水稻中异源表达该基因，均显著提高了转基因材料的解铝毒能力，说明TaALMT1是严麦耐铝机制中的重要因子（Sasakietal.,2004）。李TaALMT1后，在多个物种如拟南芥，大麦和大豆等也克隆到了TaALMT1的同源基因（Hoekengaetal.,2006；Ligaba3 etal.,2006；Liangetal.,2013）。其中，拟南芥AtALMT1的表达受铝诱导。该基因的突变体对铝毒的敏感性明显增加，说明该基因在拟南芥耐铝机制中起到了重要的作用（Hoekengaetal.,2006）。同样，油菜BnALMT1和BnALMT2两个苹果酸转运子基因在油菜根部的表达也明显受铝毒的诱导，在烟草悬浮细胞超量表达这两个基因也显著增加了悬浮细胞对铝毒的忍耐能力，暗示了这两个基因参与油菜耐铝毒害的功能（Ligabaetal.,2006）。而大豆苹果酸转运子GmALMT1基因的表达调控比其他已报道的ALMT同源基因更为复杂。Liang等（2013）的研究显示，GmALMT1的表达受到酸，铝和磷有效性的协同调控，该基因可能在大豆适应酸性土壤的过程中起着重要作用（Liangetal.,2013）。虽然诸多研究表明有机酸转运蛋白在植物耐铝胁迫过程中起着重要作用，但苹果酸转运子和柠檬酸响应铝毒的调控机制还鲜有报道。有研究表明，拟南芥的转录因子AtSTOP1基因突变后导致AtALMT1表达量降低，从而提高了突变植株对铝毒的敏感性（Sawakietal.,2009）。同样水稻中AtSTOP1的同源基因OsART1的缺失也会导致突变植株对铝更加敏感（Yamajietal.,2009）。除了STOP1转录因子以外，WRKY转录因子家族基因也参与了植物响应低磷机制和植物的耐铝机制。1.3WRKY转录因子家族调控植物适应低磷胁迫和铝毒害的研究进展WRKY转录因子家族是植物中的一个数量众多的转录因子家族（Eulgemetal.,2000）。在低等植物中WRKY转录因子家族在衣藻中只有1个成员，苔藓植物至少含有21个WRKY基因。高等植物中的WRKY转录因子成员数目更多，如，拟南芥中有72个成员，水稻中有96个成员，大豆中有127个成员。因此暗示了WRKY可能是低等植物向高等植物进化过程必须的，并有可能在高等植物复杂的调控过程中起着重要的作用（Eulgemetal.,2000；Zhouetal.,2008；Rushtonetal.,2010；Bakshietal.,2014）。WRKY基因家族的结构域较为保守，除了其蛋白质C端含有一个锌指结构域以外，其N段还含有有一到两个保守结构域WRKYGQK，该结构域简写为WRKY（Eulgemetal.,2000）。根据WRKY保守结构域的数量及其锌指结构的异同，可以将WRKY家族分为三组（Group）。含有两个WRKY结构域属于GroupI，含有一个WRKY结构域的成员属于GroupII和GroupIII。其中，GroupI和GroupII的锌指结构为C2H2型，GroupIII为C2HC型（Eulgemetal.,2000）。除了蛋白结构的保守性以4 外，WRKY转录因子家族成员还有一个共同的特性，即该家族转录因子能够结合到目的基因启动子的保守核心序列（T）（T）TGAC（C/T），即W-box，从而调控下游基因的表达（Ulkeretal.,2004）。大量研究中显示，WRKY转录因子在植物适应逆境胁迫中起着重要的调控作用（Bakshietal.,2014）。尤其是最近的研究表明，WRKY转录因子在植物响应低磷胁迫和铝毒害中也发挥着重要的调控作用。例如，玉米基因芯片的结果显示，玉米WRKY转录因子基因ZmWRKY69的表达受铝诱导，且该基因在耐铝品种中的表达量显著高于铝敏感品种（Mattielloetal.,2010）。同样，拟南芥AtWRKY33在铝处理条件下的表达量比对照高2.58倍（Goodwinetal.,2009）。这些WRKY转录因子表达量的增加暗示了它们可能参与响应植物对铝毒害的过程。最近在拟南芥的研究显示，拟南芥的另一个WRKY转录因子AtWRKY46的表达与AtALMT1的表达呈负相关关系。且在AtWRKY46突变体中，AtALMT1的表达量明显高于野生型。进一步研究结果显示，AtWRKY46能够直接作用于AtALMT1的启动子区域。该结果表明，AtWRKY46可能通过负调控AtALMT1的表达，参与调控拟南芥对铝毒害的响应（Dingetal.,2013）。多个WRKY转录因子也参与了植物对低磷胁迫的响应。以拟南芥为例，AtWRKY6、AtWRKY42、AtWRKY75以及AtWRKY45等WRKY成员在维持磷稳态过程中起着重要的调控作用（Bakshietal.,2014；Suetal.,2015）。其中，AtWRKY42超量表达植株的地上部花青素积累明显高于野生型，且其地上部磷含量明显少于突变体wrky42和野生型。造成这一表型的原因可能是AtWRKY42上调了根系PHT1;1的表达；同时，该转录因子与AtWRKY6相互作用，下调了PHO1的表达水平，从而导致根系磷的累积和地上部磷缺乏，进而影响了花青素的累积（Suetal.,2015）。同时在拟南芥中的AtWRKY44（TTG2）发现其参与调控GL2（GLABRA2）和TT12（TransparentTesta2），分别参与到拟南芥根毛的形成和种子中花青素的累积调控过程（Gonzalezetal.,2016；Johnson,2002）。另外，AtWRKY75参与了低磷对拟南芥根系生长的调控，抑制该基因的表达能明显增加转基因拟南芥根毛的数目（Devaiahetal.,2007）。最近的研究表明，AtWRKY75的表达受AtWRKY45负调控。除此以外，AtWRKY45在低磷下能够正调控PHT1;1。说明AtWRKY45也参与了拟南芥对低磷胁迫的响应（（Devaiahetal.,2007）。在玉米中异源表达棉花GbWRKY1也促进了转基因玉米侧根在低磷条件下的生长，表明该基因参与了植物根系生长对低磷的响应（（Devaiahetal.,2007）。虽然已有大量研究表明，WRKY转录因子家族在多种植5 物耐铝和适应低磷胁迫中起着重要的调控作用，但WRKY转录因子家族是否也参与了大豆适应低磷和铝毒的机制还有待进一步研究。1.4本研究的目的和意义大豆是重要的粮油作物。本研究以大豆为试验材料，通过生物信息学分析，筛选了四个IIa型GmWRKY基因，并对其亚细胞定位、转录激活活性以及表达模式等性质进行了分析。进一步筛选表达受低磷和铝毒共同调控的GmWRKY7进行初步的功能分析。初步解析该基因在大豆适应低磷和铝毒中的作用，为今后培育适应酸性土壤的大豆品种提供理论依据。6 2材料与方法2.1本研究总体技术路线克隆大豆GmWRKYs基因GmWRKY的生物信息学GmWRKY的表达模式分GmWRKYs的亚细胞定分析析位和转录激活活性分析养分缺乏对铝毒害对激素对GmWRKY表GmWRKY的GmWRKY表达的调控表达调控达的调控GmWRKY和GmWRKY的表达GmALMT1的自然和大豆耐铝性的相变异分析关性分析GmWRKY7的功能研究GmWRKY和GmALMT1的相关性分析GmWRKY在大豆耐低磷胁迫中的功能GmWRKY和GmWRKY和GmALMT1启动子GmALMT1响应铝GmWRKY7在拟南芥中的功能分析互作分析的表达模式分析GmWRKYs调控大豆适应铝毒和低磷机制7 2.2实验材料2.2.1植物材料（1）试验选用的大豆（Glycinemax）材料为粤春03-3（YC03-3）、本地2号（BD2）、巴西10号（BX10）和BD2和BX10构建的重组自交系（RIL）以及来自国内外的187个大豆品种。（2）试验选用的拟南芥（Arabidopsisthaliana）材料为哥伦比亚型（Col）。2.2.2载体和菌株试验中主要使用表达载体如下：（1）克隆载体为pEASY-Blunt（TransGenBiotech公司，中国北京），质粒图谱如图2.1a；Gateway载体系统中的克隆载体为pDONR207（Invitrogen公司，美国），如图2.1b。（a）（b）图2.1克隆载体图（a）pEASY-Blunt质粒图谱（b）Gateway载体系统中的pDONR207质粒图谱（2）荧光蛋白报告载体分为两个，一个为pBEGFP（图2.2a），其GFP融合在蛋白质的C端，另一个为Gateway载体中的pMDC-43，其GFP融合在蛋白质的N端（图2.2b）。8 （a）（b）图2.2荧光蛋白报告载体注：（a）pBEGFP质粒的部分结构图及其多酶切位点（b）Gateway载体系统中的pMDC-43质粒的部分结构图（3）超量表达载体为Gateway载体中的pMDC-32，带有编码抗潮霉素的抗性基因（图2.3）。图2.3超量表达载体pMDC-32质粒的部分结构图（4）转录激活载体为pGBKT（Clontech公司，美国），如图2.4，带有编码抗卡那霉素的抗性基因和色氨酸筛选基因TRP1。9 图2.4转录激活载体pGBKT7质粒图谱（5）酵母单杂载体为Y1Hgold系统中的pABAi载体和pGADT7载体（图2.5a和图2.5b）（Clontech公司，美国）。其中pABAi和pGADT7均带有抗氨苄霉素的抗性基因。pABAi还带有URA3尿氨酸编码基因和环酯肽抗生素基因，pGADT7带有亮氨酸编码基因LEU2。（a）（b）图2.5酵母单杂载体pABAi和pGADT7质粒图谱（a）为pABAi质粒图谱（b）为pGADT7质粒图谱10 2.2.3培养基及配方2.2.3.1细菌培养基（1）LB培养基：10g/LTrypton，5g/LYeastExtract，10g/LNaCl，12g/LAgar（固体），调节pH至7.0后121℃灭菌20min，倒板贮存于4℃备用。（2）YEP培养基：10g/LTrypton，10g/LYeastExtract，10g/LNaCl，12g/LAgar（固体），调节pH至7.0后121℃灭菌20min后，倒板贮存于4℃备用。2.2.3.2酵母单杂所用培养基（1）YPDA配方根据表2.1配方配制后115℃灭菌15min，4℃保存。表2.1.YPDA配方成分用量Bactoyeastextract10gBactopeptone20gGlucosemonohydrate20gAdeninehemisµLfate20mgBactoAgar（固体培养基，液体培养基不加）20gddH2O定容至1L（2）酵母筛选SD培养基配方根据表2.2配方配制后115℃灭菌15min，4℃保存，其中氨基酸量按照Clontech的说明进行添加。表2.2SD筛选培养基配方成分用量MinimalSDBase26.7g适当的氨基酸xgGlucosemonohydrate20gBactoAgar（固体培养基，液体培养基不加）20gddH2O定容至1L2.2.3.3MS培养基1×MS培养基中含有大量元素：1.65g/LNH4NO3、1.9g/LKNO3、0.44g/L11 CaCl22H2O、0.37g/LMgSO4·7H2O、0.17g/LKH2PO4；微量元素：0.83mg/LKI、6.2mg/LH3BO3、22.3mg/LMnSO4.4H2O、10.6mg/LZnSO4.7H2O、0.25mg/LNa2MoO4.2H2O、0.025mg/LCuSO4.5H2O、0.025mg/LCoCl2.6H2O、37.3mg/LNa2-EDTA；有机成分：5g/L蔗糖、100mg/L肌醇、2mg/L甘氨酸；固体培养基还需要加入10g/LAgar。2.2.3.4瞬时表达所用培养基（1）洋葱表皮细胞亚细胞定位培养基高渗培养基：MS培养液、0.15mol山梨醇、0.15mol甘露醇以及3g植物胶，加ddH2O定容至1L并调节pH至5.8。轰击后培养基：MS培养液、3g植物胶，加ddH2O定容至1L并调剂pH至5.8。培养液：MS培养液、30g蔗糖后加ddH2O定容至1L并调节pH至5.8。（2）烟草表皮亚细胞定位重悬液农杆菌重选浸润液：10mM氯化镁、10mMMES,、以及150µM乙酰丁香酮定容至1L。2.2.4主要试剂及配制2.2.4.1抗生素和激素配方（1）0.1g/mL氨苄青霉素溶液：将1g氨苄青霉素溶解至双蒸水定容至10mL，过滤灭菌后保存至-20℃保存。（2）0.1g/mL壮观霉素溶液：将1g壮观霉素溶解至双蒸水定容至10mL，过滤灭菌后，保存至-20℃。（3）50mg/mL卡那霉素溶液：将0.5g卡那霉素溶解至双蒸水定容至10mL，过滤灭菌后，保存至-20℃。（4）0.25g/mL羧卞青霉素溶液：将2g羧卞青霉素溶解至双蒸水定容至8mL，过滤灭菌后，保存至4℃。（5）1mg/mLGA3溶液：将0.0125gGA3溶解至1MNaOH后，用双蒸水定容至12.25mL。（6）1mg/mL6-BA溶液：将0.0125g6-BA溶解至1MNaOH后，用双蒸水定容至12.25mL。（7）1mg/mLIAA溶液：将0.0125gIAA溶解至1MNaOH后，用双蒸水定容至12.25mL。（8）1mg/mLKT溶液：将0.0125gKT溶解至1MNaOH后，用双蒸水定容至12 12.25mL。（9）1mg/mLABA溶液：逐滴加入1MNaOH至0.0125gABA，完全溶解后用双蒸水定容至12.25mL。2.2.4.2酵母转化配方（1）PEG/LiOAcmastermix（5个反应）：1.2mL50%PEG（Clontech，美国）、180µL1MLiOAc（Clontech，美国）和125µLSingle-strandedcarrierDNA。混合后分装0.3mLPEG/LiOAcmastermix至1.5mL离心管内，再加入1.5µg构建好的载体，涡旋混匀，即配即用。（2）Single-strandedcarrierDNA的配制（无需超净台操作，但使用的器皿需灭菌）：称200mg鲑鱼精DNA[salmonspermDNAtypeIIIsodiumsalt(SigmaD1636)]到已灭菌烧杯中，加入100mL灭菌水，用灭菌的搅拌子搅拌2-3h，以便充分溶解。（注意：如果DNA不能完全溶解，则置于4°C搅拌过夜）将溶解后的DNA分装到灭菌的1.5mL离心管中每管分装1mL将装有DNA的离心管开水水浴5min后，立即放进冰里。制备好的鲑鱼精DNA置于-20°C冰箱保存。2.2.4.3琼脂糖凝胶电泳（1）50×TAE贮存液：242gTris，57.1mL冰乙酸，100mL0.5mol/LEDTA（pH=8.0），加双蒸水定容至1L，工作液稀释50倍使用。（2）琼脂糖凝胶：30mL1×TAE中加入3g琼脂糖和2.5µLGoldview加热至琼脂糖完全溶解后倒入模具待用。2.2.4.5DNA抽提主要试剂（1）CTABDNA提取液：100mMTris-HCl(pH8.0)、20mMEDTA(pH8.0)、1.4MNaCl、2%(w/v)CTAB以及1%聚乙烯吡咯烷酮混合后，灭菌20min，常温保存；（2）酚氯仿异戊醇：按照氯仿:异戊醇=24:1的体积比例进行配制。（3）70%的酒精：用无菌双蒸水将70mL95%乙醇定容至100mL。2.2.4.6RNA抽提主要试剂（1）DEPC水：在1L超纯水中加入1mLDEPC后置于37℃摇床中振荡过夜后121℃，20min高压灭菌备用。（2）75%乙醇：用DEPC处理水配制75%乙醇，用高温灭菌器皿配制存放于低温冰箱。13 （3）Trizol（Invitrogen公司，美国），异丙醇（分析纯），氯仿（分析纯）。2.2.5主要药品和试剂氨苄霉素（Amp）、卡那霉素（Kan）、6-苄氨基腺嘌呤（6-Benzylaminopurine，简称6-BA）、吲哚乙酸（Indole-3-aceticacid，简称IAA）、6-糖基氨基嘌呤（Kinetin，简称KT）、乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraaceticacid，简称EDTA）购自于北京鼎国公司。Trizol和荧光定量试剂购自Invitrogen公司；DEPC购自美国AMRESCO公司；逆转录酶购自Promega公司；PCR产物纯化回收试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒购自中国天根公司；Tris购自华美生物工程公司；引物合成和DNA测序委托北京奥科公司；其余试剂均为国产分析纯产品。2.3主要设备StepOnePlus型实时荧光定量PCR扩增仪（Invitrogen公司，美国）；PTC-100型PCR扩增仪（Biometro公司，德国）；DU-640紫外分光光度计（BIO-RAD公司，美国）；DM5000B正立荧光显微镜（Leica公司，瑞士）；PDS-1000/He型基因枪（BIO-RAD公司，美国）；恒温恒湿控制系统（雅坤公司，中国）；真空冻干仪（Labconco公司，美国）；移液枪（Gilson公司，法国）；超净工作台（江苏昌平长城仪器公司，中国）；GXZ智能型光照培养箱（宁波江南仪器厂，中国）；分光光度计（Eppendorf公司，德国）；低温冰箱（海尔公司，中国）；-80℃超低温冰箱（Thermo公司，美国）；MAXQ600型低温摇床（Thermo公司，美国）；通风柜（广州泛美科学实验室设备有限公司，中国）；PB-10型pH计（Sartorius公司，德国）；AB204-S型万分之一电子分析称和PB1502-S型百分之一电子分析称（METLERTOLEDO公司，瑞士）；14 磁力加热搅拌器（Thermo公司，美国）；LSM780共聚焦显微镜（Zeiss公司，德国）；2.4实验方法2.4.1GmWRKY基因的克隆和生物信息学分析（1）大豆GmWRKY基因的数据获取：通过水稻OsWRKY71基因在phytozome网站（http://www.phytozome.net）上反复比较后筛选出4个不同的GmWRKY基因（2）基因命名：大豆中候选的四个GmWKRY分别来自不同的染色体，按照其染色体序号进行命名：GmWRKY7、GmWRKY8、GmWRKY13、GmWRKY15。（3）生物信息学分析：GmWRKY的进化树分析相关序列是从phytozome网站和NCBI网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上下载下来后在生物信息学分析软件Mega6.0上分析；同源结构域分析是在生物信息分析MEME网站（http://meme.sdsc.edu/meme/website/intro.html）上预测的；亚细胞定位是在WOLFPSORT（http://wolfpsort.org）上预测的。2.4.2GmWRKY基因表达模式分析2.4.2.1营养元素缺乏对GmWRKY基因表达的影响采用卷纸育苗法，挑选种皮无破损、大严均一的种子，用10%NaClO消毒5min，再用二级水洗6~7次。利用灭菌后的20x20cm方形滤纸进行卷纸育苗，萌发营养液为缺素处理营养液。设置6个缺素处理，分别为-N、-P、-K、-S、-Ca、-Fe和正常营养液处理作为对照。培养3~4天后，至胚根5~10cm后将幼苗分别转移到正常营养液及相应缺素处理营养液中。每个处理设置3个重复，每个重复4株苗。处理时，每两天调一次pH，每7天换一次营养液，处理至出现缺素症状收样。分别收集植株的新叶、老叶和根系，用锡纸包好迅速放入液氮保存，提取RNA，检测大豆中GmWRKY的表达模式。2.4.2.2激素对大豆GmWRKY基因表达的影响从粤春03-3大豆品种中挑选出大严均一，种皮未破裂的种子，进行次氯酸钠蒸法灭菌1后进行纸培法将种子发芽，三天后转移至加入了0.5umol/L的激素营养液（ABA，IAA，6-BA、GA以及KT）以及作为对照的正常营养液中，进行培养。分别在0h，3h，6h，12h，24h收集四株大豆的根样，提取收集的样品的RNA，检测大豆中GmWRKY的表达模式。15 2.4.2.3铝毒害对GmWRKY基因表达的影响从大豆种质资源库中的189个大豆品种中各挑选出40粒种子，种子用3%的H2O2溶液消毒处理1min后，用二级水漂洗5-6次，用1/2营养液浸泡10min，利用卷纸法培养，每张滤纸卷8-9粒种子，每个品种各五卷。进行萌发3-4天（d）后，挑选出12株长势一直的幼苗。将幼苗分为两组，每组3个重复，每个重复两株苗。将幼苗转移至含有pH为4.3的0.5mMCaCl2溶液的水培箱中进行预处理24h后，利用pH为4.3的0.5mMCaCl2溶液对第一组大豆进行正常对照处理，pH为4.3的0.5mMCaCl2溶液+50µMAlCl3进行处理第二组幼苗，测量0h和48h的根长，按照下方公式计算其相对伸长率(%)，之后的相对伸长率都是按照此公式进行计算。收集0-2cm根尖样品用液氮保存，提取RNA，检测GmWRKY和GmALMT1的表达模式。对相对根伸长率分析后挑选出耐铝品种和铝敏感品种。()铝处理后的根长-铝处理前的根长相对根伸长率(%)=()对照处理后的根长-对照处理前的根长2.4.3RNA的提取和反转录2.4.3.1植物组织基因组RNA的提取称取0.1g保存的材料，在液氮中迅速研磨成粉末，转入预冷的2mL离心管中，加入1mLTrizol，充分混匀，室温静置5min。加入0.2mL的氯仿，剧烈震荡离心管15sec，室温静置5min。将离心管置于离心机中，将离心机设置为4℃，12000r/min，离心15min。离心后的溶液分为两层，上层为溶有RNA的无色液层，下层为酚-氯仿液层。严心转移上清液至另一只新的离心管，加入等体积异丙醇，上下颠倒离心管混匀，室温放置10min。离心机设置为4℃，12000r/min，离心10min，离心后RNA沉淀于管壁和底部。弃去上清液，加入1mL75%乙醇洗涤沉淀2次，每次离心设置4℃，12000r/min，离心5min。离心后在通风橱风干沉淀2～5min，加入20μLDEPC水溶解沉淀，接下来进行反转录或者将样品置于-80℃保存。2.4.3.2植物组织基因组RNA的反转录进行反转录实验前，利用OD仪对RNA样品的OD260/OD280的数值进行测定来确定RNA样品的浓度和纯度。当OD260/OD280=1.8~2.0时，RNA纯度较高适合进行试验。本实验的反转录步骤严格按照Promega公司（美国）生产的Go-Script试剂盒的操作说明进行cDNA第一链的合成。操作步骤为：向200μL离心管中添加最大使用5μg的总RNA体积（依据测定的16 RNA浓度计算），添加1μLOligodT，然后加DEPC水至总体积5μL。混匀后将其置于PCR仪上70℃反应5min后置于冰上反应5min，用离心机离心10s。向离心管内在添加4μL5×Buffer，2μLMgCl2，1μLPCRnucleodide，0.5μLRNasin以及1μL反转录酶和6.5μLDEPC水。置于PCR仪上按照以下条件反应：25℃反应5min（退火），42℃下反应1h（延伸反应），70℃反应15min（终止反应）。反应结束后放在-20℃冰箱中备用。2.4.4实时定量PCR及其引物设计（1）GmWRKY家族基因实时荧光定量PCR的引物设计：根据已获得的GmWRKY基因家族成员设计定量引物。引物的设计软件为Primer5.0。为了保证引物扩增的特异性，每条引物设计后都在NCBI在线网站上进行大豆全基因组的特异性比对，确保其不会和其他基因错配。通过以上方法，最终确定可特异性扩增的GmWRKY的定量引物（附表1）。（2）PCR反应体系：SYBRSelectMasterMix（2×）10μL（已含有荧光矫正试剂）PrimerF0.4μL（浓度为0.1-1μM）PrimerR0.4μL（浓度为0.1-1μM）模板cDNA2.0μLddH2O7.2μLTotal20.0μL（3）PCR反应条件及数据采集：当引物的Tm值>60℃时，反应程序为95℃预变性5min，95℃下变性15sec，60℃下退火并且延伸1min并在此步骤下采集荧光，扩增40个循环当引物的Tm值<60℃时，反应程序为95℃预变性5min，95℃下变性15s，Tm温度下退火15sec，72℃延伸30sec并在此步骤下采集荧光，扩增40个循环。（4）结果分析：在StepOnePlus荧光定量仪自带软件下设定好PCR管的信息后，进行自动分析，其中标准曲线需要尽量达到0.999，根据标准曲线，软件自动计算目的基因和内参基因的相对表达量。为了实验准确，每个样品设置4个生物学重复或3个技术重复，以保证一致的反应趋势。2.4.5DNA的提取（1）收集大约0.1g的植物样品，立即提取或保存于-80℃。需要提取前先预热17 CTAB。（2）将样品放于研钵中，配合液氮，快速将样品磨成粉末状，将粉末尽量收集于一个2mL的离心管中，同时加入900μLCTAB，漩涡震荡后，在5℃中水浴30min。（3）水浴后，加入900μL酚氯仿异戊醇，上下翻转10次后，静止1min，12000rpm，离心10min。（4）离心后取上清液600μL至另一干净的1.5mL离心管中，加入400μL异丙醇，上下翻转后，静置10min，12000rpm，离心15min。（5）弃上清，用75%的乙醇清洗，12000rpm，离心5min，重复一次。（6）于通风橱中将酒精晾干，至透明状即可。加入50-100μL灭菌水或TE水，将DNA于-20℃或-80℃下长期保存。2.4.6GmWRKY基因的表达载体构建2.4.6.1GmWRKYs的Gateway系统的载体构建Gateway系统中的pMDC32（图2.3）和pMDC43（图2.2b）分别可用于过量表达和亚细胞定位，以大豆YC03-3品种cDNA为模板扩增GmWRKYs编码框序列片段，分别在引物的5’端加27bp的指定片段（附表2）。PCR反应条为94℃预变性2min，94℃下变性30sec，58℃下退火并且延伸30sec，72℃下延伸1.5min，扩增33个循环，72℃下延伸5min。PCR产物经纯化后，利用BP反应王入pDORN207中间载体（图2.1b），转化大肠杆菌DH10B。菌液测序正确后，利用质粒抽提试剂盒进行对质粒进行纯化。然后利用LR反应将正确片段转入目的载体pMDC43和pMDC32中。将质粒转化至农杆菌GV3101中后，接入至pMDC32的菌株可用于拟南芥整株转化和筛选，而接入至pMDC43的菌株可用于烟草表皮细胞转化。2.4.6.2GmWRKYs的亚细胞定位载体pBEGFP构建蛋白C端融合GFP表达载体采用pBEGFP（图2.2a），以大豆YC03-3品种cDNA为模板扩增GmWRKYs编码框序列片段，由于GmWKRY7和GmWRKY8同源性很高，所以其引物共用一对，分别在引物的5’端加XbaI和SalI的指定片段（附录2）。PCR反应条为94℃预变性2min，94℃下变性30sec，58℃下退火并且延伸30sec，72℃下延伸1.5min，扩增33个循环，72℃下延伸5min。PCR产物经纯化后王入pEASY-BluntT载（图2.1b）中，用XbaI和SalI酶切pBEGFP表达载体和重组后的T载体，回收目的片段后王接转化DH10B。抽提质粒，18 测序无误后转化农杆菌GV3101用于洋葱表皮细胞瞬时表达转化。2.4.6.3GmWRKYs的转录激活载体构建GmWKRY的转录激活载体采用pGBKT7（图2.4），以大豆YC03-3品种cDNA为模板扩增GmWRKYs编码框序列片段，分别在引物的5’端加EcoRI和SalI的指定片段（附录2）PCR反应条为94℃预变性2min，94℃下变性30sec，58℃下退火并且延伸30sec，72℃下延伸1.5min，扩增33个循环，72℃下延伸5min。PCR产物经纯化后王入pEASY-BluntT载（图2.1b）中，用XbaI和SalI酶切pGBKT7表达载体和重组后的T载体，回收目的片段后王接转化DH10B。抽提质粒，测序无误后转化酵母菌株AH109检测其转录激活活性。2.4.6.3GmWRKYs和GmALMT1启动子的酵母单杂载体构建GmWKRY的转录激活载体采用pGBKT7（图2.4），以大豆YC03-3品种cDNA为模板扩增GmWRKYs编码框序列片段，分别在WRKY7、WRKY8、WRKY13引物的5’端加EcoRI和SacI的指定片段；在WRKY15引物5’端加EcoRI和XmaI的指定片段；在ALMT1启动子引物5’端加SacI和SalI的指定片段的引物序列如下：PCR反应条为94℃预变性2min，94℃下变性30sec，58℃下退火并且延伸30sec，72℃下延伸1.5min，扩增33个循环，72℃下延伸5min。PCR产物经纯化后王入pEASY-BluntT载中，用XbaI和SalI酶切pGADT7表达载体和重组后WRKY7、WRKY8、WRKY13的T载体；用EcoRI和XmaI酶切pGADT7表达载体和重组后WRKY15的T载体；用SacI和SalI酶切pABAi表达载体和重组后ALMT1的T载体回收目的片段后分别王接后转化DH10B。抽提质粒，测序无误后先将ALMT1重组载体转化酵母菌株Y1Hgold，然后分别将WRKY基因转化至该酵母中，检测其是否能够互作。2.4.7大豆GmWRKY的亚细胞定位2.4.7.1瞬时表达转洋葱表皮细胞选取新鲜洋葱，剥去外层，用灭菌解剖刀撕取第二三层外表皮，切成3×3cm左右方块（皿中央一块，围绕中央再放几块），置于高渗培养基，使外表皮接触培养基，培养约4h。称取60mg金粉，放入1.5mL离心管中，加入1mL新配的70%乙醇，涡旋3-5min，静置15min，离心5s后弃上清。加1mL无菌水，涡旋1min，静置1min，离心219 秒，弃上清，重复此步骤三次。加入无菌的50%甘油1mL重悬直至金粉均匀悬浮，分装20份，每份50μL，可打2枪。未使用的可在-80℃或-20℃下进行长期保存。制备微弹。在50μL金粉悬液中依次加入：10μLGmWRKYs-GFP质粒DNA（1μg/μL）、50μL2.5MCaCl2和20μL0.1M亚精胺。李续涡旋3min直至金粉均匀悬浮，10000rpm离心5-10秒。弃上清，加入250μL预冷的无水乙醇，涡旋1-2min直至金粉均匀悬浮，12000rpm离心1min。弃上清，加入60μL无水乙醇重悬，吸取30μL包裹好DNA的微弹均匀涂于载片中央，自然风干；将载片装于支持环内（有微弹的一面向上），压紧，用于轰击；利用PDS-1000/He型基因枪进行轰击洋葱表皮。轰击后样品的处理和GFP荧光观察。轰击后材料转至等渗培养基中培养约24h。将洋葱表皮严心剥下，平铺在加有等渗培养液的载玻片上，盖上盖玻片。在荧光显微镜下观察荧光，确认表达成功后，用30%蔗糖溶液处理20min进行质壁分离，再用激光共聚焦显微镜观察扫描，共聚焦显微镜激发波长为488nm。2.4.7.2瞬时表达转烟草表皮细胞将分别携带GFP-GmWRKYs和共定位载体的农杆菌GV3101菌株接种于加了相应抗生素的YEP培养基，28℃振荡培养16h。5000rpm,10min离心后，将菌体沉淀用烟草表皮细胞转化重悬液重悬至OD600=0.45-0.55。转化烟草叶片前，将菌体悬浮液在22℃-24℃下遮光静置2-3h。将含GFP-GmWRKYs和共定位载体的菌液等量混合，然后转化3-4周龄烟草的叶片。转化后3天后，用激光共聚焦扫描显微镜在488nm(GFP)/587nm(mChe)波长的激发光下观察荧光在烟草表皮细胞内的分布。2.4.8拟南芥的转化与后代筛选蘸取甘油保存的单克隆菌和3μL卡那霉素溶液到3mLYEP中，28℃摇菌过夜活化。活化后的菌液倒入100mLYEP（含100μLKan）中，28℃摇菌过夜。将菌液分装到50mL离心管中，5000rpm离心10min，弃上清。用等体积5％蔗糖重悬菌体，加入20μLSilwetL-77表面活性剂，将拟南芥花序浸泡至重悬后的菌液中转化拟南芥，每组材料浸泡约1min，罩上保鲜袋保持湿润避光24h。转化后的植株在土壤中李续生长，待成熟后收集种子。收集成熟的拟南芥种子，晾晒或风干约一周后，放入1.5mL离心管保存。种子的灭菌与筛选（培养基筛选）：取约0.1mL体积的种子放入1.5mL离心管，加入1mL70%乙醇漂洗5min，离心沉淀种子，吸干乙醇。加入1.5%的次氯酸钠漂20 洗5min，离心沉淀种子，吸干次氯酸钠。用无菌水漂洗7次，用水或0.2%琼脂重悬浮种子，并将其均匀地铺在1/2MS盐培养基（含20mg/L潮霉素）平板上。4℃处理24h后，移入22℃植物培养箱。约2周后，可见健康存活的转基因植株出现，筛选得到的转基因T1代植株移入土壤中李续生长。生长到5-6片叶数后进行PCR鉴定。收集PCR检测阳性的拟南芥植株的种子如上再重复筛选过程，所得的T2代阳性植株单株收获种子。取每株约100粒，种植于MS培养基（含20mg/L潮霉素）平板上。观察其分离规律。长出100％健康严苗的株系作为下一步的实验材料。按3:1分离的株系再种一代重复上述筛选步骤得T3代纯合体。2.4.9拟南芥花青素含量测定-1取0.100g拟南芥地上部样品置于三角瓶中，加10ml0.1mol·L盐酸乙醇溶液，在60℃水浴中加10ml提取液浸提30min，把溶液倒入25ml容量瓶中，再加5ml提取液浸提15min,把溶液倒入25ml容量瓶中，再加5ml提取液浸提15min,把溶-1液倒入25ml容量瓶中，共浸提1h，最后定溶到25ml。以0.1mol·L的盐酸乙醇溶液做参比液，在分光光度计测定提取液在530nm、620nm、650nm波长下的光密度值。以下面花青素含量公式计算拟南芥的花青素的含量。ODλV花青素含量（nmol/g）=××1000000εm2.4.10数据统计及分析本实验所有数据均使用Microsoft®Excel2007（MicrosoftCompany）进行平均数和标准误差计算，利用SPSS（StatisticalProductandServiceSolutions）统计软件进行单因素方差分析，利用Duncan’s法进行多重比较，利用MEGA6.0（MolecularEvolutionaryGeneticsAnalysis6.0）中的最大似然法进行进化树分析，利用在线生物信息分析软件MEME（http://meme-suite.org/）进行同源结构域分析。21 3结果与分析3.1大豆IIa型WRKY基因成员的生物信息学分析3.1.1大豆GmWRKY的进化树和结构域分析通过同源克隆，获得4个GmWRKY转录因子家族成员基因。根据其在基因组中的位置，将其命名为：GmWRKY7（网上的基因号）,GmWRKY8（网上的基因号）,GmWRKY13（网上的基因号）和GmWRKY15（网上的基因号）。其中，在（Zhouetal.,2008）等（2008）的研究中将GmWRKY13和GmWRKY8命名为GmWRKY27和GmWRKY40。利用MEGA6.0对其他物种中已报道的WRKY和候选的GmWRKY进行进化树分析。进化树结果显示，进化树可分为两个大支。每个大群又分为两个亚支。其中，四个GmWRKY与AtWRKY40位于同一亚群（图3.1）。而参与拟南芥响应低磷胁迫的AtWRKY75和AtWRKY45则位于另一大支中的同一亚支。利用在线同源结构域分析软件MEME（http://meme-suite.org）对四个大豆中的WRKY蛋白进行同源结构域的分析。结果发现，候选的四个WRKY蛋白均含有一个WRKY结构域，属于IIa型WRKY。另外，在其C端有一个典型的C2H2锌指蛋白结构域，在其N端含有一个LZ结构域（核心序列为LREELxRVNxENKKLKEMLx2Vx6L），这三个核心结构域使这四个GmWRKY结合到特定的W-box序列上，对下游基因进行调控（图3.2）。22 Glyma08g23380.1Glyma07g02630.1Glyma15g00570.1Glyma13g44730.1AtWRKY40OsWRKY71HvWRKY1HvWRKY2OsWRKY28OsWRKY22AtWRKY6OsWRKY53OsWRKY33AtWRKY20OsWRKY30GmWRKY54AtWRKY28OsWRKY3AtWRKY56AtWRKY45AtWRKY75GmWRKY21OsWRKY13AtWRKY22GmWRKY13OsWRKY42AtWRKY63AtWRKY46AtWRKY70OsWRKY45OsWRKY30图3.1大豆GmWRKY的进化树分析注：大豆GmWRKY的序列从phytozome（http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）获得，其他已报道的WRKY序列，从NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）获得，进化树分析软件为Mega6.0。23 基因同源结构域Glyma08G23380.1Glyma07G02630.1Glyma13G44730.1Glyma15G00570.1OsWRKY71AtWRKY40图3.2GmWRKY的同源结构域注：利用MEME（http://meme-suite.org）WRKY蛋白分析同源结构域。其中为WRKY结构域，为C2H2锌指结构域，为LZ结构域（LREELxRVNxENKKLKEMLx2Vx6L）。24 3.2大豆GmWRKY基因家族成员的生物学特性分析3.2.1大豆GmWRKY的转录激活活性分析为了确定候选GmWRKY基因是否具有转录激活活性，将4个GmWRKY基因构建到PGBKT7载体，转化酵母AH109菌株。将转化后的菌株以及阴性对照在单缺组氨酸（-His）和色氨酸（-Trp）上的SD板上生长36h后观察其生长情况。结果显示，这四个GmWRKY蛋白在单缺色氨酸（-Trp）上的SD板能够生长，氮在缺组氨酸（-His）的SD培养基上不能生长。说明这四个GmWRKY不具有转录激活活性（图3.3）。ABCDESD/-TrpSD/-His图3.3大豆GmWRKY转录激活活性分析注：利用酵母单杂分析了大豆GmWRKY的转录激活活性。其中A、B、C、D和E分别为阴性对照，GmWRKY7，GMWRKY8，GmWRKY13和GmWRKY15。3.2.2大豆GmWRKY的亚细胞定位分析进一步利用洋葱表皮和烟草叶片细胞对这4个大豆GmWRKY进行了亚细胞定位分析。洋葱表皮细胞的亚细胞定位结果显示，35S：GFP的荧光信号在整个洋葱表皮细胞均能检测到。而大豆GmWRKY8和GmWRKY7定位于核。虽然GmWRKY13的定位在细胞核内，但其分布呈成点状分布。与其他3个GmWRKY不同，GmWRKY15定位于细胞质内，也呈点状分布。推测其可能定位于质体上（图3.4a）。为了再次确定洋葱表皮的亚细胞定位结果，本研究进一步利用烟草叶片细胞对GmWRKY7和GmWRKY13进行了亚细胞定位。结果显示，与洋葱表皮瞬时表达结果一致，GmWRKY7定位于细胞核上。而GmWRKY13-GFP的荧光信号不仅在细胞核，而且在细胞质中也检测到了其荧光信号（图3.4b）。25 （a）GFPBrightMergedGmWRKY8GmWRKY7GmWRKY15GmWRKY1335S::GFPGFPM-CherryMerged（b）GmWRKY7GmWRKY1335S::GFP图3.4GmWRKY的亚细胞定位注：35S::GFP和35S::GmWRKYs-GFP在洋葱表皮细胞（a）和烟草下表皮细胞（b）中的亚细胞定位分析。其中，在图a中由左至右分别为GFP通道，光镜通道以及GFP通道和光镜通道的融合图像。。在图b中，由左至右分别为GFP通道，M-Cherry通道以及GFP通道和M-Cherry通道的融合图像。26 3.3大豆GmWRKYs基因表达模式分析3.3.1营养元素的缺乏对大豆GmWRKYs基因表达模式的影响为了进一步解析GmWRKYs在大豆响应养分缺乏中的调控作用，本研究检测了养分胁迫，包括缺氮（-N）、缺磷（-P）、缺钾（-K）、缺硫（-S）、缺钙（-Ca）、以及缺铁（-Fe）等对大豆GmWRKY7、GmWRKY8和GmWRKY15的表达模式的影响。结果显示，营养元素的缺乏均显著调控了GmWRKYs基因的表达。不同养分胁迫条件下，GmWRKY7在大豆不同部位的表达水平有所不同。在新叶中，缺钙明显抑制了GmWRKY7的表达，其表达水平仅为对照的73%。而缺氮，缺磷、缺钾、缺硫和缺铁处理明显上调了该基因的表达。在这些处理条件下，其表达水平分别为对照的10.7、4.7、9.7、5和13倍。在老叶中，所有检测的养分胁迫均上调了GmWRKY7的表达，其中在缺氮，缺磷、缺钙和缺铁处理条件下，该基因的表达量分别是对照的4.3、4.8、3.4和2.5倍。根系中缺硫明显抑制了GmWRKY7的表达，与对照相比，该基因的表达量被下调了30%。缺氮、缺磷、缺钾、缺钙和缺铁则明显上调了该基因的表达，其表达量分别为对照的2.3、2.4、3.7、1.7以及3.3倍（图3.5）。与GmWRKY7相似，新叶中GmWRKY8被缺钙处理下调表达，其表达量仅为对照的79%。而该基因在缺氮，缺磷、缺钾、缺硫和缺铁处理中均上调表达，其表达量分别为对照的3.2、6.7、10.7、3.8以及17.6倍。在老叶中，缺素处理均显著提高了GmWRKY8的表达水平。其中，缺氮，缺磷和缺钙处理条件下，GmWRKY8的表达量分别是对照的5.7、6.9、8.4倍。根系中GmWRKY8的表达量在缺氮和缺硫条件下分别下调了37.5%和32.2%；但缺磷，缺钾，缺铁和缺钙处理显著地上调了该基因的表达，其表达量分别为对照的1.2、2.3、1.9和2.3倍（图3.5）。GmWRKY15在新叶的表达与上述两个基因相似。其表达水平受到缺钙下调了79%，而在缺氮，缺磷、缺钾、缺硫和缺铁处理中分别上调了3.7、3.7、1.9、2.1和6.1倍。在老叶中，GmWRKY15的表达在低钾和低钙条件下分别下调了61%和35%。但在其他处理条件下，该基因的表达均被上调。其中，与对照相比，GmWRKY15的表达量被缺磷处理上调了3倍，被缺氮、缺硫和缺铁则提高了1倍。而在根部，缺硫和缺钙处理对GmWRKY15表达水平无显著影响。但在其他缺素处理条件下，该基因的表达倍明显上调。其中，缺氮、缺磷、缺钾和缺铁条件下该基因的表达量分别为对27 照的2.7、2.6、4.2以及2.4倍（图3.5）。新叶老叶根GmWRKY7GmWRKY7GmWRKY71.54.82.4＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊3.2＊＊＊＊1.01.6＊＊1.6＊＊0.5＊＊＊＊0.8＊＊000GmWRKY8GmWRKY8GmWRKY81.83.3＊3＊＊＊＊＊＊＊＊1.22.2＊＊2＊＊达量＊＊表＊＊＊＊对0.61.11＊＊＊＊＊＊相＊＊0＊＊00GmWRKY15GmWRKY15GmWRKY15＊＊＊3＊＊3.62.12＊＊2.4＊1.4＊＊＊＊＊＊＊＊＊1＊＊1.20.7＊＊＊＊＊000CK-N-P-K-S-Ca-FeCK-N-P-K-S-Ca-FeCK-N-P-K-S-Ca-Fe图3.5GmWRKYs响应元素缺乏的表达模式分析注：大豆种子萌发三天后，进行营养元素缺乏处理。其中CK为正常处理，缺素处理包括缺氮处理（-N），缺磷处理（-P），缺钾处理（-K），缺硫处理（-S），缺钙处理（-Ca）和缺铁＊＊＊处理（-Fe）。处理十天后采样，检测不同GmWRKY基因的表达水平。：0.01<ρ<0.05；：ρ<0.01；28 3.3.2部分激素处理对大豆GmWRKYs基因表达模式的影响进一步检测了大豆根系GmWRKYs基因的表达对部分激素,包括生长素（IAA）、赤霉素（GA3）、细胞分裂素（CK）、脱落酸（ABA）、6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）和激动素（KT）等的响应。结果显示，不同时间的激素处理对GmWRKYs表达的调控不同。三种激素包括GA3，ABA和IAA处理在短时间（<3h）内均上调了GmWRKY7的表达水平，但6h后该基因的表达水平恢复到与0h一致（图3.6a，b，c）。KT处理1h后，GmWRKY7的表达量显著下降，3h后恢复到0h的水平，12h后其表达量又略有提高（图3.6e）。6-BA处理对GmWRKY7的表达无显著性的影响（图3.6d）。GmWRKY8的表达量在GA3处理1h后提高了2.3倍，但在6h后其表达水平明显下降，在处理12h后，其表达水平又恢复到处理前的水平（图3.6f）。ABA处理后1h时该基因的表达略有下降，但在在3h时后恢复到处理前的水平（图3.6g）。IAA处理3h后该基因表达量迅速下降，并维持该表达量至12h处理（图3.6h）。6-BA和KT处理均明显抑制了GmWRKY8的表达。图3.6i和j显示，6-BA处理12h后，该基因表达量相对于处理1h时下调了53%，同时KT处理12h后，该基因的表达量下调45%。GmWRKY15在GA3和IAA处理条件下的表达模式没有明显的变化（图3.6k，m）。而ABA处理3h后其表达量比处理前上调了1.7倍（图3.6l）。6-BA和KT处理1h后抑制了该基因的表达水平，其表达量仅为处理前的42%和50%。这种抑制作用一直持续至处理后12h（图3.6n，o）。29 GmWRKY7GmWRKY8GmWRKY151.5＊＊2.10.9afk＊＊1.0＊＊1.40.60.50.70.3＊＊0000.91.21.5bgl＊＊＊＊0.60.81.00.30.40.50000.9chm1.20.9＊＊＊＊0.60.80.6＊0.30.40.3相对表达量0000.6din2.10.9＊0.41.40.6＊＊＊＊＊＊0.20.70.3＊＊000＊0.61.20.9ejo＊＊0.40.80.6＊＊＊＊＊0.20.40.3＊＊0000h1h3h6h12h0h1h3h6h12h0h1h3h6h12h图3.6大豆GmWRKYs响应激素的表达模式分析注：激素处理包括GA3（a，f，k）、ABA（b，g，l）、IAA（c，h，m）、6-BA（d，i，n）和KT（e，j，o）。处理浓度均为0.5mM，处理0h、1h、3h、6h以及12h后取根部样品检测GmWRKYs＊＊＊的表达模式。：0.01<ρ<0.05；：ρ<0.01；30 3.3.3铝毒害对大豆GmWRKYs基因表达模式的影响3.3.3.1铝毒害调控大豆GmWRKYs基因的表达本研究进一步检测了GmWRKYs在铝毒害条件下的表达模式。本研究检测了不同时间段铝毒害对大豆根尖2厘米处，GmWRKYs表达水平的影响。结果显示，GmWRKY7的表达水平在铝处理后4h达到最高，为处理前的10.1倍。随后，该基因的表达量基本保持不变（图3.3a）。相似的，GmWRKY8的表达量在铝处理4h后达到最大，是处理前的6.9倍。但处理8h后，其表达量明显下降为处理前的2.6倍，此后基本维持不变（图3.3b）。而GmWRKY15的表达水平在铝处理4h后表达量明显提高，为处理前的5倍，但在处理8h后恢复到处理前水平。铝处理12h又上升至处理前表达量的4.5倍，此后基本保持不变（图3.3c）。这些结果说明候选的GmWRKYs基因可能参与调控大豆响应酸性土壤上的铝毒害过程。1.8（a）＊＊＊＊＊＊1.2＊＊0.60＊＊2.4（b）1.6＊＊＊＊＊＊相对表达量0.801.5（c）＊＊＊＊＊＊1.00.5＊00h4h8h12h24h图3.7大豆根尖GmWRKYs响应铝毒的时间表达模式注：大豆幼苗在PH为4.3、0.5mMCaCl2，100uM的AlCl3溶液下处理0，4，8，12和24h后，分＊别检测GmWRKY7（a）、GmWRKY8（b）和GmWRKY15（c）在不同时间的表达量。：0.01<ρ<0.05；＊＊：ρ<0.01；31 3.3.3.2铝调控的GmWRKYs表达的自然变异分析3.3.3.2.1大豆铝敏感性的自然变异分析为了进一步验证GmWRKYs基因对铝毒的响应是否存在着基因型差异，且其基因型差异是否与大豆耐铝能力之间存在相关性，本研究首先以相对根伸长率（RRE，Relativerootelongation）为耐铝性的指标，对131个来自国内外各地的大豆品种进行了耐铝性筛选。结果显示，所评价的大豆种质中，53个大豆基因型为铝敏感型（RRE<18%），78个品种为耐铝型（RRE>18%）（图3.8a）。进一步对大豆耐铝性与生长地域，根构型和磷效率进行了相关性分析。结果显示，国外品种的耐铝性稍高于国内品种，而北方品种的耐铝性明显高于南方品种和国外品种（图3.8b）。大豆的铝敏感性也影响了大豆对磷有效性的响应。在土壤中施用磷肥后，耐铝大豆种质的产量增加高于铝敏感种质（图3.8c）。另外，不同根构型的大豆种质对铝的敏感性不同，大豆的耐铝能力随着根系变浅而增强。浅根型的大豆种质明显比深根型的大豆种质具有较高的耐铝能力（图3.8d）。32 50（a）40频率3020020406080相对根伸长率(%)60300（b）（c）4520030100相对根伸长率(%)产量百分比(%)1500-100北方品种南方品种国外品种耐铝品种铝敏感品种60（d）40相对根伸长率(%)200浅根型深根型图3.8大豆品种耐铝性与地域和不同磷水平的产量的相关性分析。注：（a）和（b）为不同地域的大豆品种的耐铝性分析，（b）中横坐标为不同地域的大豆品种，纵坐标为在50uM铝处理下的相对根伸长率（c）为铝敏感和耐铝大豆品种在不同磷水平下的产量产量增加百分比=（施磷产量-不施磷产量）/不施磷产量1003.3.3.2.2铝调控的GmWRKYs表达量的自然变异分析33 本研究进一步检测了铝敏感性不同的大豆种质中GmWRKYs基因响应铝毒害的表达模式，对基因的相对表达量和耐铝能力做了比较分析。结果显示，GmWRKY7在三个耐铝基因型的相对表达量较铝敏感基因型高，而GmWRKY8和GmWRKY15在耐铝基因型的相对表达量较铝敏感基因型低(图3.9）。这些结果说明GmWRKY7与GmWRKY8和GmWRKY15在大豆耐铝机制中的调控作用可能有所不同。铝敏感基因型耐铝基因型0.2GmWRKY780GmWRKY830GmWRKY1560处理表达量)200.140相对表达量1020处理表达量/-Al000(+Al010203001020300102030图3.9：GmWRKY基因的表达模式与大豆耐铝能力的相关性分析。注：相对根伸长为+Al处理48h根生长量/-Al处理48h根生长量×100。3.4大豆GmWRKY7的功能研究3.4.1大豆GmWRKY7与GmALMT1启动子相互作用的分析前期的研究结果表明，大豆适应酸性土壤的关键基因GmALMT1的表达受铝毒上调(Liangetal.,2013)。同时，利用在线网站PLACE（http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html）对该基因ATG上游2580bp的启动子区域进行分析，发现该区域存在17个潜在的WRKY结合位点W-box，其中，两个区域为W-box富集的域(-1923bp至-1734bp和-81bp至-507bp)，暗示某个GmWRKY能够结合至GmALMT1的启动子上游并调控GmALMT1的表达（图3.10）。34 300027002400210018001500120090060030002580bp-1923-1734-507-81图3.10GmALMT1启动子分析注：利用PLACE网站（http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html)进行启动子分析其中为W-box为W-box富集区域。利用酵母单杂实验进一步探究GmWRKY与GmALMT1的启动子之间是否存在相互作用。首先从大豆基因组中克隆GmALMT1的启动子区域至pABAi载体中和GmWRKYs至pGADT7载体中。构建好载体后将含有GmALMT1的pABAi载体转化至Y1Hgold酵母菌株中（图3.11a），然后在含有不同浓度的环酯肽抗生素（AureobasidinA，AbA）缺尿氨酸的SD培养基上进行AbA浓度筛选（图3.11b）。当AbA浓度达到500ng/ml时转化株系的生长完全被抑制，因此选择AbA浓度为500ng/ml的条件进行酵母单杂实验。（a)pALMT1pABAiY1hgoldMaker（b)SD-UraSD-UraSD-UraSD-Ura+100ng/mlAbA+200ng/mlAbA+500ng/mlAbA2500bp图3.11GmALMT1启动子的酵母转化及其AbA浓度筛选注：(a)为ALMT1启动子转化至Y1HGOLD中的PCR检测酵母菌株的电泳图。(b)为筛选合适的AbA浓度除了GmWRKY15没能构建到pGADT7载体外，其他三个GmWRKYs-均顺利获得GmWRKYs-ADGAL4的载体，将构建好的载体转化至已经含有GmALMT1启动子片段的Y1Hgold中，并在不同AbA浓度下检测互作。当AbA浓度达到500ng/ml时，阴性对照和转化了GmWRKY8、GmWRKY13的酵母生长完全被抑制，而转化了GmWRKY7的酵母能够正常生长。酵母单杂的实验结果表明，在酵母中GmWKRY735 能够结合到GmALMT1的启动子区域上，而其GmWRKY8、GmWRKY13不能和GmALMT1进行互作，暗示着GmWRKY7可能调控了GmALMT1的表达对铝毒的响应。SD-LeuSD-Leu+500ng/mlAbApALMT1+ADGAL4pALMT1+ADGAL4-GmWRKY7OD值：0.20.020.0020.00020.20.020.0020.0002图3.12GmALMT1启动子的酵母转化及其AbA浓度筛选注：为在AbA浓度不同的SD-Leu培养基上，将转化的阳性酵母菌株点板后生长72h。3.4.2GmALMT1与GmWRKY7响应铝毒害的表达模式分析为了进一步确定GmWRKY7是否参与了GmALMT1的转录调控，本研究分别检测了铝毒害条件下，GmWRKY7和GmALMT1的表达模式。结果显示，铝处理条件下，GmALMT1的表达量随着时间的延长逐渐升高，到4h达到最大，随后其表达水平逐渐降低，12h后几乎为0。而GmWRKY7的表达量迅速增高，当处理4h后GmWRKY7的表达量达到处理前的10倍，此后一直维持在7.4倍至11.2倍之间（图3.13）。这些结果暗示了GmWRKY7可能参与了GmALMT1的转录调控。15GmALMT1GmWRKY710相对表达量500481224处理时间（h）图3.13铝调控的GmALMT1和GmWRKY7的表达模式比较分析注：GmALMT1和GmWRKY的相对表达量都以0h的相对值为1进行标准化3.4.2.2超量表达GmWRKY7对拟南芥响应低磷胁迫的影响构建GmWRKY7的Gateway超量表达载体GmWRKY7-pMDC-43，利用农杆菌转化拟南芥。转基因拟南芥经过潮霉素筛选和定量PCR检测。获得两个稳定的超量表达株系OX7-5和OX7-15。分别对野生型和超量表达株系进行高磷（HP，1.25mM磷）36 和低磷（LP，1.25uM磷）处理，处理后14天和21天后检测其对低磷胁迫的响应。结果如图3.14所示，低磷条件下，超量表达GmWRKY7的拟南芥叶片积累的花青素含量明显低于野生型。低磷处理14天后，野生型的地上部花青素含量达到1.96nmol/g，而两个转基因株系OX7-5和OX7-15叶片中的花青素含量仅有为1.04和0.95nmol/g，分别是对照的53.4%和48.7%。处理21天后，野生型的花青素含量上升为5.26nmol/g，而两个转基因株系OX7-5和OX7-15叶片中的花青素含量仅有为1.05和1.87nmol/g，分别是对照的20.0%和35.5%。有趣的是，虽然超量表达株系花青素的积累明显低于野生型，其生物量和侧根数等均与野生型相比无明显差别。并且无论在高低磷处理下，其超量表达株系和野生型的地上部和根部的磷含量都无差别（图3.15）。（a）WTOX7-5OX7-15HPLP（b）（c））2.48）61.6＊＊＊＊4＊＊0.82＊＊花青素含量（nmol/g00WTOX7-5OX7-15WTOX7-5OX7-15花青素含量（nmol/gWTOX7-5OX7-15WTOX7-5OX7-15高磷低磷高磷低磷图3.14GmWRKY7超量表达拟南芥响应磷处理下的花青素积累注：野生型拟南芥WT和GmWRKY7超量表达拟南芥株系OX7-5和OX7-15在高磷（1.25mM磷）和低磷（1.25uM磷）下处理21天后的地上部，其中标记为0.5cm。（c）为磷处理21天后的花青＊＊＊素含量。：0.01<ρ<0.05；：ρ<0.01；37 6060（a））（b））4545ggDWggDW30301515磷含量（μ磷含量（μ00WTOX7-5OX7-15WTOX7-5OX7-15WTOX7-5OX7-15WTOX7-5OX7-15地上部根部地上部根部0.6（c）9（d））0.460.23根冠比00WTOX7-5OX7-15WTOX7-5OX7-15#/cm侧根密度（WTOX7-5OX7-15WTOX7-5OX7-15高磷低磷高磷低磷图3.15GmWRKY7超量表达拟南芥磷处理生理数据注：野生型拟南芥WT和GmWRKY7超量表达拟南芥株系OX7-5和OX7-15在高磷（图a）和低磷（图b）下处理14天后的地上部和地下部的全磷含量。（c）（d）分别为磷处理14天后的根冠比（地下部重量/地上部重量）以及侧根密度（根/cm）。38 4讨论与结论4.1大豆GmWRKY家族基因分析通过同源克隆获得4个与拟南芥AtWRKY40同源的大豆WRKY基因，分别命名为GmWRKY7、GmWRKY8、GmWRKY13、GmWRKY15。通过分析这四个WRKY成员以及来自水稻，拟南芥，大麦等植物中已报道的WRKY家族成员的系统进化关系发现，与其他WRKY相比，AtWRKY40与这四个GmWRKY的同源性较高（图3.1）。但其功能是否也具有相似性还有待进一步的研究。进一步对GmWRKYs的同源结构域进行了分析。结果表明，这四个GmWRKYs与拟南芥的AtWRKY40一样，具有三个典型的结构域，分别为WRKY核心序列、位于C端的C2H2型锌指结构域以及位于N端的LZ结构域。根据（Eulgemetal.,2000）的划分方法，这四个WRKY均属于为IIa型WRKY转录因子（图3.2）。已报道的IIa型WRKY转录因子在植物抗耐机制中起着重要的作用（Bakshietal.,2014）。因此，为进一步研究这四个GmWRKY转录因子在植物中可能的功能，本研究首先利用酵母系统检测其转录激活活性。结果发现，这四个GmWRKY蛋白均无转录激活活性（图3.3）。该结果与（Zhouetal.,2008）等（2008）的研究结果类似。该研究结果显示，在所检测的9个大豆GmWRKY蛋白中，有4个不具有转录激活活性，其中包括了本研究所涉及到的GmWRKY13。他们进一步利用酵母双杂方法发现，GmWRKY13能够形成双二聚体，暗示了该蛋白只有在形成双二聚体时才能正确行使功能（Zhouetal.,2008）。其他三个GmWRKY是否也需要形成二聚体才能行使功能还需进一步研究。进一步对这四个GmWRKY的亚细胞定位进行了分析。结果显示，GmWRKY7和GmWRKY8定位于细胞核上（图3.4）。这与大多数已报道的WRKY转录因子的亚细胞定位结果一致（Zhouetal.,2008）。细胞核的亚细胞定位暗示了GmWRKY7和GmWRKY8可能作为转录因子参与了大豆下游基因的转录调控。与GmWRKY7和GmWRKY8蛋白不同的是，GmWRKY13定位于细胞核和质体中，而GmWRKY15则主要定位在质体里（图3.4）。通过生物信息学分析发现，GmWRKY15很有可能定位于线粒体或叶绿体中，但其具体定位还有待进一步试验的论证。由于线粒体和叶绿体不仅对植物的碳循环起着重要作用，且线粒体在植物适应逆境中也起着十分关键的作用（VanAkenetal.,2013）。因此，对GmWRKY13和GmWRKY15的亚细胞定位的研究将有助于进一步拓宽人们对叶绿体和线粒体在植物适应逆境中功能的认识。39 4.2大豆GmWRKYs的表达模式分析前人的研究结果显示，不同植物的WRKY同源基因的时空表达调控对逆境胁迫的响应不同。以大豆GmWRKY基因家族为例，在检测的9个GmWRKY基因中，8个的表达受干旱以及7个受到盐害的上调（Zhouetal.,2008）。其中，GmWRKY49为组成型表达，GmWRKY17，GmWRKY21andGmWRKY62的表达受冷害上调。这些表达模式的结果暗示了不同的GmWRKY基因在大豆响应外界环境胁迫中的功能可能不同（Zhouetal.,2008）。另外，元素的缺乏和毒害对植物的WRKY基因的表达也有明显的调控作用（Zhouetal.,2008）。例如，铝处理上调玉米ZmWRKY69和拟南芥AtWRKY33的表达，但抑制了AtWRKY46的表达。这些WRKY转录因子表达量的增加暗示了它们可能参与响应植物对铝毒害的过程（Mattielloetal.,2010）。除了铝毒害以外，低磷胁迫也调控了植物WRKY转录因子的表达。以模式拟南芥为例，AtWRKY6、AtWRKY42、AtWRKY75以及AtWRKY45等WRKY成员的表达水平在低磷条件下均明显上调。说明了WRKY转录因子参与了植物对低磷胁迫的响应（Bakshietal.,2014；Suetal.,2015）。虽然WRKY转录因子基因的表达模式在许多植物上已经进行了研究，但大豆的GmWRKY转录因子家族基因的表达与重要营养元素缺乏之间的关系尚未明确。因此，本研究首先对营养元素缺乏调控的大豆GmWRKY基因家族的表达模式进行了分析，结果显示，营养元素的缺乏对这三个基因（GmWRKY7，GmWRKY8和GmWRKY15）在植株不同部位的表达均有不同程度的调控。其中，缺磷均上调了这三个GmWKRY在叶片和根系的表达水平（图3.5）。这与上述拟南芥的多个WRKY基因对低磷胁迫的表达模式相似。低磷调控的表达模式暗示了这三个大豆GmWRKY基因在大豆适应低磷胁迫中起着重要的作用。前人的研究显示，一些非生物胁迫如干旱可能通过激素来调控GmWRKY基因的表达。例如，LtWRKY21能够与ABA协同调控HVA22的表达（Zouetal.,2004）。因此，为了明确缺素对GmWRKY转录因子家族基因表达的调控是否与植物激素有关，本研究选取多种激素对大豆根系进行处理，并检测了这三个GmWRKY基因的表达对激素的响应。结果显示，所检测的激素，包括GA3、ABA、IAA、KT和6BA等，或抑制了GmWRKY基因的表达，或仅瞬时上调了其表达（图3.6）。这与低磷调控的GmWRKY基因的表达不同。说明这些激素可能没有参与低磷信号对GmWRKY基因表达的调控。另外，本研究还对铝调控的GmWRKY基因的表达模式进行了分析。结40 果显示，铝处理能明显提高大豆根尖GmWRKY7，GmWRKY8和GmWRKY15的表达（图3.7）。说明这些基因可能参与了大豆根系对铝毒害的适应性机制。4.3GmWRKY与大豆铝毒适应性的关系为了进一步分析GmWRKY基因与大豆铝毒适应性的关系。本研究分析了铝敏感性不同的大豆品种中铝调控的GmWRKY基因的表达水平。结果显示，与铝敏感基因型相比，耐铝基因型中铝调控的GmWRKY7的相对表达量较高，而铝调控的GmWRKY8和GmWRKY15的相对表达量较低。与本研究结果相似，Mattiello等（2010）通过基因芯片对玉米基因的表达进行了高通量的分析，发现铝调控的玉米ZmWRKY69的表达量在耐铝品种中显著高于铝敏感品种（Mattielloetal.,2010）。这些结果暗示了植物WRKY转录因子的表达可能可以作为植物的耐铝品种的筛选指标之一。为初步明确大豆GmWRKY转录因子的下游调控途径，本研究选取受铝上调表达的大豆苹果酸转运子GmALMT1基因的启动子，分析了GmWRKY转录因子与该启动子的互作关系。结果发现，四个GmWRKY转录因子中，仅GmWRKY7能与GmALMT1启动子互作。通过这两个基因的表达模式分析发现，GmALMT1的表达在铝处理4严时后达到最高，然后缓慢下降，而GmWRKY7的表达在处理4严时后升高并一直保持不变，两者呈现负相关的关系。类似的结果在拟南芥也有报道。Ding等（2013）发现AtWRKY46能够直接作用于AtALMT1的启动子区域，且其表达表达与AtALMT1的表达呈负相关关系。因此，AtWRKY46可能通过负调控AtALMT1的表达，参与调控拟南芥对铝毒害的响应（Dingetal.,2013）。与拟南芥铝下调的AtWRKY46的表达不同的是，GmWRKY7的表达受铝上调。其可能的原因是，大豆受耐铝胁迫的早期，需要分泌大量苹果酸螯合细胞周围的铝离子。但随着时间的延长，活性铝离子的数目减少后，过多的苹果酸分泌并不利于细胞代谢和胞内pH的平衡（Hofflandetal.,1992）。因此，大豆可能通过提高GmWRKY7的表达量来抑制GmALMT1的表达，减少苹果酸的分泌。但其具体工作机制还需进一步的验证。4.4GmWRKY与大豆低磷适应性的关系植物的WRKY转录因子家族成员数量众多。该家族基因在植物适应非生物胁迫，包括干旱、盐害、冷害、热害、营养元素缺乏以及氧化胁迫等的过程中起到了重要的作用（Eulgemetal.,2000；Bakshietal.,2014）。本实验通过分析三个GmWRKY基因的表达缺素处理的响应，发现三个WRKY基因在响应低磷的过程中都能够显著的上调41 表达，也暗示这大豆中WRKY转录因子家族可能在调节植物磷吸收和维持体内磷稳态的过程中起着正调节作用（图3.6）。进一步在拟南芥中超量表达GmWRKY7，发现超量表达该基因后，转基因拟南芥在叶片花青素的积累明显减少（图3.16）。有趣的是，转基因植株的根冠比和侧根密度等指标与野生型无明显差异，暗示了GmWKRY7在植物体内参与花青素累积调控的功能。最近的研究显示，超量表达AtWKRY42的转基因拟南芥在低磷条件下过量积累花青素，且转基因植株地上部的磷含量也明显减少，其表型与pho1突变体的表型相似（Suetal.,2015）。因此，大豆GmWRKY7通过何种途径调控植物花青素的累积对低磷胁迫的响应尚待进一步的研究。4.5结论本论文通过对大豆的WRKY家族进行生物信息学分析，并通过克隆和异源表达属于IIa型GmWRKY基因，进行鉴定和表达模式分析后筛选得到GmWRKY7进行进一步的功能分析，结论总结如下：1、四个大豆IIa型WRKY蛋白GmWRKY7、GmWRKY8、GmWRKY13、GmWRKY15在酵母中无转录激活活性。GmWRKY7和GmWRKY8定位于细胞核中，GmWRKY13定位于细胞核和细胞质中，GmWRKY15定位于细胞质中。2、营养元素的缺乏对这四个基因在植株不同部位的表达均有不同程度的调控。其中，缺磷和缺铁上调了这四个GmWKRY在叶片和根系的表达水平。缺氮和缺硫均上调了这四个GmWKRY基因在叶片的表达量。但在根系中，缺氮上调了GmWKRY7和GmWRKY15的表达量，抑制了GmWRKY8的表达。缺硫则抑制了GmWKRY7和GmWRKY8的表达，对GmWRKY15的表达量无明显影响。缺钾除了抑制GmWRKY15在老叶的表达以外，均上调了各基因在各部位的表达。缺钙抑制了这四个基因在新叶以及GmWRKY15在老叶的表达，但提高了GmWKRY7和GmWRKY8在老叶和根系的表达，对于GmWRKY15在根系的表达量则无显著影响。3、激素调控了GmWKRYs基因的表达。其中，GA3、ABA和IAA能够瞬时提高GmWRKY7的表达水平；KT则瞬时抑制该基因的表达。GmWRKY8的表达水平在GA3和IAA处理条件下瞬时上调，但在6BA和KT处理条件下受到明显抑制。另外，除ABA瞬时上调，6BA和KT抑制GmWRKY15的表达水平以外，其他激素对该基因的表达无明显影响。42 4、大豆在低磷下的相对产量、地域以及根构型和大豆的耐铝性具有相关性。GmWRKYs可以响应铝毒处理，并且GmWRKY7在铝敏感品种中的相对表达量明显低于耐铝品种，而GmWRKY8和GmWRKY15具有相反的结果。5、在酵母水平上，GmWRKY7能够直接结合GmALMT1的启动子区域，结合GmWRKY7和GmALMT1响应铝毒的表达模式结果，GmWRKY7可能为GmALMT1的一个转录抑制子。6、铝处理能明显提高大豆根尖GmWRKY7，GmWRKY8和GmWRKY15的表达。于铝敏感基因型相比，耐铝基因型品种中铝调控的GmWRKY7的相对表达量较高，而铝调控的GmWRKY8和GmWRKY15的相对表达量较高。7、在拟南芥中超量表达GmWRKY7，表明GmWRKY7在低磷情况下参与到拟南芥的地上部花青素累积过程。43 致谢时光荏苒，研究生三年的学习研究生活也接近尾声，而一切都似乎都在昨日。第一次参加文献阅读，第一次进行论文翻译，背下的第一段英文摘要，做出来的第一个实验等等都感觉并不程远，导师的教诲都还在耳畔，同学们的帮助还在眼前，却发现自己却要李续向前走了。在根系生物学研究中心的成长是我走向科研道路上最为重要的一块基石，在这里学习到了严谨、认真、刻苦与自我思辨。在此，除了不舍就是想对所有一切支持、关心和帮助过我的亲人、老师、同学和朋友衷心地说声感谢，是你们所做的一切形成了我不断向前，超越自我的动力！首先，我要感谢我的导师田江研究员和梁翠月副研究员。由于自己专业的变动，刚刚入学时对于自己的专业和相关实验的不了解，使我感受到自己的无力与迷茫，是梁老师对我投入了很多精力与时间，甚至手把手从最基本的实验和原理一步一步教会我，帮我解释文献中难懂的理论，从本研究开题到结束，多次与导师讨论，而这些讨论也都历历在目，讨论过程中与导师的思维碰撞成为了我重要的一笔财富。两位导师严谨求实、敏捷的思维以及思辨能力都时时刻刻都在影响着我，让我受益匪浅，我也将以两位导师为榜样，在学业上再攀高峰，在人生的道路上不断自我进取。然后，我要感谢实验室所有其他的老师，是您们的辛勤付出和耐心指导，为同学们提供了优越的学习科研平台，让我们可以全身心的投入到学习和研究生活中。我要特别感谢廖红教授。是您在我们入学时，不计辛劳，牺牲您宝贵的周末时间监督我们不断学习和阅读英文文献，使我们能够快速的融入到实验室的学习和研究生活中。不仅如此，在平常的seminar中午文献阅读，廖老师的独特的思考问题的角度也让我们感受到科研的魅力，并且在平常的研究生活上对于我们的指导也一直遵循着“授人以鱼，不如授之以渔”的原则，以德为先的处事风范让我们思考问题更加的全面和严谨。廖老师渊博的知识，敏捷的思维，也是我以后研究生活中不断追求的明灯。感谢王秀荣老师为我的研究和实验都提供了关键性的意见。王老师的和蔼和细腻的处事风格，也让我受益匪浅。感谢王金祥老师、陆星老师、贾静老师、陈康老师、许锐能老师在平常试验过程中给予了宝贵意见和无私指导，您们教人不悔、严谨治学的态度也时刻激励着我；还要感谢实验室张君老师、方俊女士、谢苕芹女士在生活和试验上的帮助和照顾。同时，我还要感谢实验室每一位同学对于我的关心和帮助！感谢李娇娇师姐、44 徐舟师姐、孙莉丽师姐、陈志坚师兄、周佳师姐、徐峰师兄、张晴师兄、李凯师兄、陈丽玉师姐、徐晓鹏师兄、陈曦师兄、张海燕师姐、薛迎斌师兄对于我实验的无私指导和帮助；感谢一直以来相互鼓励和帮助的同级：彭文婷、莫严惠、林志豪、王桂花；感谢王雅楠、齐婉冬、吴炜炜、刘东、林燕等师弟师妹在试验上给我的大力支持和帮助。还要特别感谢我的舍友兼同学的杨韬师兄和陶平，谢谢你们一直的鼓励和照顾，我也会怀念我们一起生活的日子！在此，一并表示感谢，有了你们的陪伴，让科研之路上有了不少有趣的风景，在脆弱时也是我必不可少的强心剂。最后，感谢我的亲人们！谢谢父母亲对于我的支持和理解，在求学路上对于我的信任；谢谢姐姐和姐夫在生活上的帮助，谢谢你们现在帮助我承担了一大部分对于爸妈的责任，让我能够不断求学，我也不会辜负你们对于我的期望！感谢整个家族在背后的默默支持！感谢能够一起奋斗努力的胡彦婷同学，也希望在接下来的博士生活中李续向前！最后衷心感谢百忙之中抽空评阅本论文和参加答辩的各位专家、教授！本研究是在国家自然科学基金项目资助下完成。彭俊楚2016年4月45 参考文献程程.中国大豆种植业发展的思考[J].大豆科学,2013(05):711-713.胡可,韩科厅,戴思兰.环境因子调控植物花青素苷合成及呈色的机理[J].植物学报,2010(03):307-317.贾贾东,马佩勇,边严峰,等.植物花青素合成代谢途径及其分子调控[J].西北植物学报,2014(07):1496-1506.李李李,刘秀娣,周伟,等.有效利用土壤营养元素的作物育种新技术研究[J].中国科学(B辑化学生命科学地学),1995(01):41-48.梁翠月,廖红.植物根系响应低磷胁迫的机理研究[J].生命科学,2015(03):389-397.林郑和,陈荣冰.植物铝毒及其耐铝机制研究进展[J].中国农学通报,2009(13):94-98.王保明,陈永忠,王湘南,等.植物低磷胁迫响应及其调控机制[J].张建农林大学学报(自然科学版),2015(06):567-575.王王王,傅玉清,贾荣娟,等.黄淮海地区大豆育种的研究[J].大豆科学,2001,20(04):266-269.严严严,张张张.植物营养遗传学[M].中国农业出版社,1997.张张张,王激清,张伟峰.中国主要粮食作物肥料利用现状与提高途径[J].土壤学报,2008,45:915-924.BakshiM,OelmüllerR.WRKYtranscriptionfactors:Jackofmanytradesinplants[J].PlantSignaling&Behavior,2014,9(2):e27700.ChenJ,LiuY,NiJ,etal..OsPHF1regulatestheplasmamembranelocalizationoflow-andhigh-affinityinorganicphosphatetransportersanddeterminesinorganicphosphateuptakeandtranslocationinrice[J].PlantPhysiology,2011,157(1):269-278.ChiouT,LinS.Signalingnetworkinsensingphosphateavailabilityinplants[J].AnnualReviewofPlantBiology,2011,62:185-206.DevaiahBN,KarthikeyanAS,RaghothamaKG.WRKY75transcriptionfactorisamodulatorofphosphateacquisitionandrootdevelopmentinarabidopsis[J].PlantPhysiology,2007,143(4):1789-1801.DingZJ,YanJY,XuXY,etal..WRKY46functionsasatranscriptionalrepressorofALMT1,regulatingaluminum-inducedmalatesecretioninArabidopsis[J].ThePlant46 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附表2GmWRKYs基因相关载体构建的引物序列基因名正向引物(5’-3’)反向引物(5’-3’)pDONR207GmWRKY7GGGGACAAGTTTGTACAAAAAGGGGACCACTTTGTACAAGAAAAGCAGGCTTCATGGATTGTTCAGCTGGGTCATTATTGTGCAACAATCATGGTCTTCCTGGmWRKY13GGGGACAAGTTTGTACAAAAAGGGGACCACTTTGTACAAGAAAAGCAGGCTTCATGGATTATTCATGCTGGGTCATTATTGTGCAACATCATGGATGATTAACTTTTCCTGAGpBEGFPGmWRKY7GTACTCTAGAAGACATGGATTGGTCAGTCGACTTATTGTGCAACATTCATCATGGATCTTCCTGGmWRKY8GTACTCTAGAAGACATGGATTGGTCAGTCGACTTATTGTGCAACATTCATCATGGATCTTCCTGGmWRKY13GTACTCTAGAAGTCATGGATTATGTCAGTCGACTTATTGTGCAACATCATCATGGATGTTTTTCCTGAGGmWRKY15GTACTCTAGAATATATGCTTCTCGTCAGTCGACTTATTATTGTGCATCACTTCACAAACACATTTTTCCAGAGpGBKT7GmWRKY7GTACGAATTCAGACATGGATTGGTCAGTCGACTTATTGTGCAACATTCATCATGGATCTTCCTGGmWRKY8GTACGAATTCAGACATGGATTGGTCAGTCGACTTATTGTGCAACATTCATCATGGATCTTCCTGGmWRKY13GTACGAATTCAGTCATGGATTATGTCAGTCGACTTATTGTGCAACATCATCATGGATGTTTTTCCTGAGGmWRKY15GTACGAATTCATATATGCTTCTCGTCAGTCGACTTATTATTGTGCATCACTTCACAAACACATTTTTCCAGAGpGADT7GmWRKY7GTACGAATTCAGACATGGATTGGTCAGAGCTCTTATTGTGCAACATTCATCATGGATCTTCCTGGmWRKY8GTACGAATTCAGACATGGATTGGTCAGAGCTCTTATTGTGCAACATTCATCATGGATCTTCCTGGmWRKY13GTACGAATTCAGTCATGGATTATGTCAGAGCTCTTATTGTGCAACATCATCATGGATGTTTTTCCTGAGGmWRKY15GTACGAATTCATATATGCTTCTCGTCAGGGCCCTTATTATTGTGCATCACTTCACAAACACATTTTTCCAGAGpABAiGmALMT1CTGAGAGCTCCCTATCGATCTGCTGAGTCGACAACTACTATGCAATGTATAAAGGCAGGCTGTGAGAAGC52