1043.利用mtt法测定不同浓度顺铂对hela细胞增殖的抑制效果

《1043.利用mtt法测定不同浓度顺铂对hela细胞增殖的抑制效果》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、利用MTT法测定不同浓度顺铂对Hela细胞增殖的抑制效果摘要：目的：观察不同浓度顺铂对Hela细胞增殖的抑制作用，并探讨出最适合用于抑制Hela增殖的浓度梯度。方法：采用MTT比色法对经不同浓度顺铂处理后的Hela细胞进行测定，检测不同浓度顺铂对细胞增殖的抑制情况。结果：0.3～1μg/mL浓度的顺铂对Hela细胞的增殖主要起到促进作用；1～7.5μg/mL梯度内的顺铂作用不清晰，而7.5～80μg/mL这一浓度梯度内的顺铂则都是起抑制作用，且抑制作用随浓度升高而增强；只是在7.5～25μg/mL这一浓度梯度内，不同浓度顺

2、铂间的抑制作用存在较大差异，而在25～80μg/mL这一范围内顺铂的抑制作用相差不大。结论：高浓度顺铂对Hela细胞的增殖确实有抑制作用，而低浓度顺铂则不然，所以通过归结之后可知，较适合用于抑制Hela细胞增殖的顺铂梯度应在10～25μg/mL之间，可以是10μg/mL，15μg/mL，20μg/mL，25μg/mL。关键词：MTT法，顺铂，Hela细胞，增殖，抑制MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazo-liumromide，汉语化学名为3-(4

3、，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，是一种黄颜色的染料。MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法；其检测原理是：外源性MTT在哺乳类动物类活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶的作用下还原为水不溶性的蓝紫色（或蓝色）结晶甲瓒（Formazan），并沉积在细胞中；在通常情况下，甲臜生成量与活细胞数成正比[1]。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，因此用酶联免疫检测仪在490nm或570nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。而死细胞中不含琥珀酸脱氢酶，因此加入MTT不会有反应。该方法已广泛用于一些生物活

4、性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。本实验即是利用已知浓度的Hela细胞培养后的吸光度生成细胞生长趋势曲线，然后通过该曲线推测出经不同浓度顺铂处理后的已知浓度的Hela细胞的增殖情况，从而检测出顺铂对Hela细胞增殖的抑制效果，并找出最适的顺铂抑制梯度。1材料与方法1.1材料美国进口的Hela细胞1.2方法(1)配置MTT溶液称取MTT0.5克，溶于100ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存(2)稀释细胞用0.25

5、%胰蛋白酶消化贴壁生长的对数期细胞，用含5%～10％胎牛血清的培养液将细胞吹打为单细胞悬液，调整细胞浓度约为5´105个/ml；取200μl加入1800μl的培养液内，得到浓度约为5´104个/ml作为原初浓度的细胞。对原初浓度的细胞进行1：1倍比稀释，分别得到1：2、1：4和1：8的稀释细胞（细胞浓度约为2.5´104个/ml、1.25´104个/ml和0.625´104个/ml）(3)接种细胞取上述的各浓度的细胞各200μl，接种到96孔板内；同一浓度的细胞接种4孔作为重复实验。同时，将剩余的各浓度混成未知浓度的细胞，

6、吸取200μl作为待测样品同样加到96孔板的4个孔内(4)再接种重新调整细胞悬液浓度，使细胞浓度为2～3´104/ml，在96孔板中，每孔加入细胞悬液200μl，使每孔内的细胞数为4000～6000个，每个浓度至少接种4孔作为重复实验(5)培养与处理细胞同一般培养条件，梯度浓度组的培养3～5天；药物处理组的培养24h后，吸出培养液分别加入不同浓度的抗肿瘤药物顺铂各200μl，继续培养(6)呈色由一开始培养算起，第3天于倒置显微镜下观察细胞生长情况后，每孔加5mg/ml的MTT溶液20μl，继续孵育4h，终止培养；快速翻转培

7、养板，弃去孔内培养上清液；然后每孔加DMSO150μl，振荡30min，使结晶物充分融解(7)比色选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果(8)计算与分析通过Excel软件以吸光值为横坐标，接种细胞浓度为纵坐标绘制曲线，生成接种细胞浓度与吸光值间的趋势曲线及其指数方程，根据该方程计算出各种药物处理对细胞增殖率的影响注：本实验还设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜）和对照孔（细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜）2结果2.1Hela细胞浓度与吸光值的关系未加药物之前，利用MTT法测得的不同浓度Hela细

8、胞与吸光值之间的对应关系如表-1和图-1所示(表中OD值均由均值算得)：表-1不同浓度Hela细胞对应的光吸收值细胞浓度500025001250625OD4900.4180.1140.0380.015图-1Hela细胞浓度与光吸收值间的趋势曲线2.2顺铂对Hela细胞增殖的抑制作用利用MTT法检测得的不