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1、利用MTT法测定不同浓度的5-氟尿嘧啶对Hela细胞增殖作用的抑制效果摘要：采用MTT法测定不同浓度的化疗药物5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-Fu）对宫颈癌Hela细胞增殖作用的抑制效果，发现5-氟尿嘧啶对Hela细胞的增殖抑制基本上呈量效依赖关系。不同浓度的5-氟尿嘧啶对宫颈癌Hela细胞的生长均有一定的抑制作用。5-氟尿嘧啶的化疗剂量在50~150ug/ml之间时，既可以得到较高化疗的效果,又可以尽量减少副作用。关键词：MTT法、5-氟尿嘧啶、Hela细胞、抑制前言：近年来，宫颈癌的化学治疗越来越受到国内外的重视，
2、5-氟尿嘧啶作为DNA抑制药物常用于临床宫颈癌的治疗,其作用机理为通过抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，从而抑制DNA的生物合成。由于肿瘤患者对不同剂量化疗药物的敏感性差异较大,且化疗药物具有毒副作用。因此,治疗肿瘤的化疗药物敏感剂量的筛选对指导临床用药,提高疗效,减轻毒副作用等具有重要意义。在多种体外抗癌药物筛选方法中,MTT法是近年来备受推崇的检测方法〔1〕。我们通过用不同浓度的5-氟尿嘧啶作用于体外培养的宫颈癌Hela细胞,用MTT法检测其抑制率,对实验结果进行分析，寻找最佳的治疗剂量。1.材料和方法1.1材料Hela细胞株、5-氟尿嘧
3、啶、胰蛋白酶、噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、96孔细胞培养板、新生牛血清、CO2细胞培养箱、酶联免疫检测仪、多用途振荡器。胰蛋白酶消化液用Hanks液配制成浓度为0.25%溶液；MTT用PBS液配制成浓度为5mg/ml溶液；培养液应用灭菌蒸馏水、新生牛血清配制成含10%血清的细胞培养液,分别用0.22μm的微孔滤器除菌,4℃保存。1.2方法1.2.1消化 用0.25%的胰蛋白酶消化经传代稳定生长并且生长状态良好的贴壁Hela细胞,并用含10%新生牛血清的培养液吹打、配成均匀的近似单个细胞的悬液。1.2.2计数 细胞计数板计
4、数后,用含10%新生牛血清的培养液调整细胞悬液的细胞浓度约为5×104个/ml，再稀释为约为2.5×104个/ml、1.25×104个/ml、0.625×104个/ml，用于制作细胞浓度曲线；另调整为2~3×104个/ml，用于接种于药物处理。96孔板，每孔加入细胞悬液200uL，使每孔内的细胞数约为5000个。1.2.3接种 将稀释制备好的Hela细胞悬液以每孔200μL接种于96孔培养板中,每一浓度4个平行孔。共设置1个空白对照组(1行,无细胞的含10%新生牛血清的培养液)，在2到6行中分别添加200μL5×104个/ml、2.5
5、×104个/ml、1.25×104个/ml、0.625×104个/ml的Hela细胞悬浮液，用于制作细胞浓度曲线。在第8到12行添加200μL2~3×104个/mlHela细胞悬浮液。1.2.4培养细胞 将接种完成的96孔细胞培养板移入CO2培养箱中,在37℃、5%CO2及饱和湿度条件下进行培养。1.2.5药物处理在培养液内加入5-氟尿嘧啶，配成以下8组不同的5-氟尿嘧啶实验药物浓度梯度：A组为1ug/ml、10ug/ml、100ug/ml、1000ug/ml；B组为20ug/ml、40ug/ml、80ug/ml、160ug/ml；5
6、C组为40ug/ml、80ug/ml、160ug/ml、320ug/ml；D组为50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml、400ug/ml；E、F组均为75ug/ml、150ug/ml、300ug/ml、600ug/ml,G组为200ug/ml、400ug/ml、800ug/ml、1600ug/ml；H组为300ug/ml、600ug/ml、900ug/ml、1500ug/ml；Hela细胞在培养箱内培养24h后，吸出原培养液，加入以上不同浓度的5-氟尿嘧啶药物培养液，每空添加200uL，每个浓度接种4孔作重复实验。换液后继
7、续放回CO2培养箱中培养。1.2.6对照设置：本实验设置调零组（只加培养液、MTT、二甲基亚砜），1组对照组（细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜）。1.2.7呈色：培养箱内继续培养到第3天，于倒置显微镜下观察细胞生长情况后，每孔加5mg/ml的MTT溶液20uL，CO2培养箱中培养4h，终止培养：快速翻转培养板，弃去孔内培养上清液；然后每孔加DMSO150uL，振荡30min，使结晶物充分溶解。1.2.8比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔的光吸收值，记录结果。2.结果全部利用MicrosoftExcel进行分组处理(表
8、中每一数值=每浓度4孔的测定平均值-空白组测定平均值)。细胞存活率=（实验组OD值）/（对照组OD值）×100%;细胞增殖抑制率=[（对照组OD值-实验组OD值）/对照组OD值]×100%。若该值为正说明药物对细胞增殖具
