最新分子克隆工具酶1课件ppt.ppt

《最新分子克隆工具酶1课件ppt.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、分子克隆工具酶1工具酶类主要用途限制性核酸内切酶切割DNA分子形成片段DNA连接酶DNA片段的连接重组大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ切口平移法标记DNA探针T7DNA聚合酶DNA序列测定分析TaqDNA聚合酶PCR体外扩增技术多核苷酸激酶末端标记法制备探针S1核酸酶去除双链DNA的局部单链常用工具酶与基因克隆技术核酸酶是通过切割相邻的两个核苷酸残基间的磷酸二酯键，导致多核苷酸链共价键断裂的一类水解酶，可分为核糖核酸酶(RNase)和脱氧核糖核酸酶(DNase)。按其水解断裂核酸分子的不同方式：核酸外切酶(exonuclease):从核酸末端顺次水解磷酸二酯键核酸内切

2、酶(endonuclease)：内部磷酸二酯键2.1限制性核酸内切酶限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。限制（Restriction）细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。①Dam甲基化酶GATC腺嘌呤N6位置引入甲基。②Dcm甲基化酶CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上引入甲基。修饰（Modification）2.1.2限制酶的分类与命名限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解外源DNA的一类酶，其功能是避免外源DNA的干扰或噬菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。由于R/M现象的发现使得

3、核酸内切酶成为基因工程重要的工具酶。根据酶的功能、大小和反应条件，及切割DNA的特点，可以将限制性内切酶分为三类：Ⅰ型酶、Ⅱ型酶、Ⅲ型酶。三种类型限制酶的主要特性差异比较距识别序列下游24-26bp处识别序列内或附近特异性切割距识别序列1kb处随机性切割切割位点GAGCCCAGCAG旋转对称序列TGAN8TGCTAACN6GTGC识别序列ATP、Mg2+、SAMMg2+ATP、Mg2+、SAM（S-腺苷甲硫氨酸）辅助因子异源二聚体同源二聚体异源三聚体蛋白结构双功能单功能多功能限制修饰Ⅲ型Ⅱ型I型主要特性I型酶属复合功能酶，兼具限制、修饰两种功能。核酸内切酶、

4、甲基化酶、ATP酶和DNA解旋酶4种活性。显著特点：识别位点与切割位点不一致。酶分子首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年从大肠杆菌B株和K株分离的。代表：EcoB和EcoK。I型限制性内切酶识别位点序列EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC未甲基化修饰的特异序列。需ATP、Mg2+和SAM(S-腺苷甲硫氨酸)。作用机理在距离特异性识别位点约1000～1500bp处随机切开一条单链。Recognizesitecut1-1.5kb切割位点有核酸内切酶和甲基化酶作用。酶分子由两个亚基组成。M亚基负责位点识别与修饰，R亚基具

5、有核酸酶活性。在完全肯定的位点切割DNA，但反应需要ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷甲硫氨酸）。在基因工程操作中用途不大。EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAGⅢ类限制性内切酶1970年，由H.O.Smith和K.W.Wilcox（威尔科克斯）从流感嗜血菌中分离出来。分离的第一个酶是HindⅡ。限制-修饰系统分别由限制酶与修饰酶两种不同酶分子组成，分子量小，能识别DNA的特殊序列，种类多，在基因工程中起重要作用。Ⅱ型限制性内切酶能识别双链DNA的特殊序列，并在这个序列内进行切割，产生特异的DNA片段。其种类繁多。通常所指的DNA限制性核酸内切酶即

6、为此类。在基因工程技术中，I型不能用，Ⅲ型酶基本不用，Ⅱ型酶最有用。限制酶的命名1973年Smith和Nathans提出限制酶的命名原则，1980年Roberts对其系统化，如今简化成：HindⅢ，来源菌株Haemophilusinfluenzaed嗜血流感杆菌d株HindⅢ微生物属名种名株名(品系)发现序数识别双链DNA分子中4～8对碱基的特定序列大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构5’…GCTGAATTCGAG…3’3’…CGACTTAAGCTC…5’EcoRI的识别序列EcoRI的切割位点2.1.3Ⅱ型限制酶的特

7、性与DNA切割(1)基本特性大多为回文序列5’…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRI37℃5’…G-C-T-G-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…C-G-A-C-T-T-A-A-POH-G-C-T-C…5’退火4-7℃5’…G-C-T-GA-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…C-G-A-C-T-T-A-AG-C-T-C…5’OHPOHPEcoRI产生的5’粘性末端5’…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-A-C-G-T

8、-C-C-T-C…5’PstI37℃5’…G-C-T