分子克隆工具酶及其应用

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1、分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。第一节限制性内切核酸酶一.限制性内切酶的发现1.细菌限制修饰系统的发现WernerArber于1962-1968年发现，1968年分离到I型限制酶。2.限制酶HindII的发现H．O．Smith和Wilox于1970年首

2、次从流感嗜血杆菌（H.influenzae）中发现并分离到HindII限制酶。3.SV40限制图谱和转录图谱的绘制D.Nathans（1971年）用HindII绘制SV40的限制酶谱。二.限制修饰系统的种类1.I型：由三个基因构成，hsdR；hsdM；hsdS（hostspecificityforDNArestrictionmodificationandspecificity）位于染色体上，三个基因构成一个复合体，限制酶需要ATP、Mg2+、SAM（５—腺苷甲硫氨酸）。2.II型：限制与修饰基因产物独立起作用，在Ｅ.coli中这两种基因位于质粒上。3

3、.III型：修饰酶与Ｉ型酶相同，hsdＭ与hsdＳ基因产物结合成一亚单位，限制酶是独立存在的。上述三个系统中，只有II型限制酶与甲基化酶具有相当高的核苷酸识别特异性，因而被广泛用于基因工程中。三.限制性内切酶的定义、命名1.定义：广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指II型限制酶。2.命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。例如：HindⅢ前三个字母来自于菌种名称H.influenzae，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。EcoRI—EscherichiacoliRIHindⅢ—Haemophilusinflu

4、ensaedⅢSacI(II)—StreptomycesachromagenesI(Ⅱ)四．限制酶的特点1.识别顺序和酶切位点１）识别４-8个相连的核苷酸MboINGATCN；AvaIIGG(A/T)CCBamHIGGATCC：PpuMIPuGG(A/T)CCPyNotIGCGGCCGC；SfiIGGCCNNNNNGGCCCCGGN’N’N’N’N’CCGGFokI5’-ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’3’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’外侧，产生５’-端突起２）富含ＧＣ３）对称性—双对称EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’４）切点大多数在

5、识别顺序之内，也有例外５）限制酶切后产生两个末端，末端结构是５’-Ｐ和３’-ＯＨ2.末端种类１）３’-端突起，个数为２或４个核苷酸PstI5’-CTGCAG-3’5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’3’-GACGTC-5’２）５’-端突起，个数为２或４个核苷酸EcoRI5’-GAATTC-3’5’-GOHPAATTC-3’3’-CTTAAG-5’3’-CTTAAPHOG-5’３）平齐末端SmaI5’-CCCGGG-3’5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’3’-GGGCCC-5’４）非互补的粘性末端ａ）切点在识别顺序之外的，如：

6、FokIFokI5’-GGATG(Ｎ)9-3’5’-GGATG(N)93’-CCTAC(Ｎ)13-5’3’-CCTAC(N)13ｂ）能识别简并顺序的，如：AvaIAvaI5’-CPyCGPuG-3’CCCGGG;CTCGGG;CCCGAG;CTCGAG５）相容性末端如：BamHIGGATCCBglIIAGATCTMboI,Sau3AINGATCN上述几种限制酶产生的DNA片段仍可相连，由此形成的重组分子能被MboI和Sau3AI识别和酶切，但BamHI和BglII的识别机率只有1/16。BamHI+MboIA/C/G/TGATCT/C/G/ABamH

7、I和BglII(AGATCT)两种酶产生的相容性末端，相连后不能为两种酶所识别和酶切。BamHI+BglIIA/GGATCT/C不同末端的连接特性:除第4种末端不能进行不同DNA分子或同种DNA分子不同切点产生的末端相连外，其余4种末端可以相互连接。五.异源同序酶（isoschizomer，同裂酶）1.定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制酶2.特点：1）识别相同顺序2）切割位点的异同KpnIGGTACCAsp718GGTACCSstICCGCGGSacICCGCGG限制酶的星反应（staractivity）1.特点:限制酶识别序列特异性降低

8、2.发生星反应的限制酶和条件（见下页）3.星反应的利用和避免表1具有星反应的限制性内切酶与条件限制酶