《分子克隆工具酶》ppt课件

《《分子克隆工具酶》ppt课件》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、第2章分子克隆工具酶Ø在基因工程的实际操作中，工具酶的使用是一项基本技术。Ø在体外对DNA进行分离纯化、连接重组或者修饰合成等，都会涉及一系列酶促反应。Ø用于基因工程的工具酶种类繁多(表2.1)、根据其功能可粗略分为限制酶、连接酶、聚合酶和修饰酶4类。表2.1常用工具酶与基因克隆技术工具酶类主要用途限制性核酸内切酶切割DNA分子形成片段DNA连接酶DNA片段的连接重组大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ切口平移法标记DNA探针T7DNA聚合酶DNA序列测定分析TaqDNA聚合酶PCR体外扩增技术多核苷酸激酶末端标记法制备探针S1核酸酶去除双链DNA的局部单链主要教学内容2.1限制性核酸内切酶限制

2、性核酸内切酶的发现及其生物功能；限制酶的分类与命名；Ⅱ型限制酶的特性与DNA切割；影响限制性核酸内切酶活性的因素；2.2DNA连接酶基本性质；连接作用；影响连接反应的因素；2.3DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶；Klenowfragment；T7DNA聚合酶；T4DNA聚合酶；修饰过的T7DNA聚合酶；逆转录酶；2.4核酸修饰酶核酸酶；碱性磷酸单酯酶；T4多核苷酸激酶；末端转移酶。2.5甲基化酶教学要求教学目标与要求掌握限制酶和连接酶的性质与功能；了解聚合酶和修饰酶在基因操作中的用途。重点与难点限制酶的分类；常用限制酶的性质；影响连接反应的因素；聚合酶的分类与性质。需掌握专业词汇限

3、制与修饰；星号活性；偏爱现象；Klenow片段；Reversetranscriptase，同裂酶与同尾酶。2.1限制性核酸内切酶核酸酶是通过切割相邻的两个核苷酸残基间的磷酸二酯键，导致多核苷酸链共价键断裂的一类水解酶，可分为核糖核酸酶(RNase)和脱氧核糖核酸酶(DNase)。按其水解断裂核酸分子的不同方式：核酸外切酶(exonuclease):从核酸末端顺次水解磷酸二酯键核酸内切酶(endonuclease)：内部磷酸二酯键2.1.1限制性核酸内切酶的发现及其生物功能寄主控制的限制(restriction)与修饰(modification)现象：人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存

4、在着一些功能性障碍。λ噬菌体在感染某一宿主后，再去感染其他宿主时会受到限制。即所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）。细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降解。限制与修饰现象图解Arber限制修饰酶Ø1968年，MeselsonandYuan从E.coli菌株Ｋ和Ｂ中发现了Ⅰ型限制酶；Ø1970年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出HindⅠ和HindⅢ限制（Restriction）限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。修饰（Modification）细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的

5、限制性内切酶识别切割。①Dam甲基化酶GATC腺嘌呤N6位置引入甲基。②Dcm甲基化酶CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上引入甲基。2.1.2限制酶的分类与命名Ø限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解外源DNA的一类酶，其功能是避免外源DNA的干扰或噬菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。由于R/M现象的发现使得核酸内切酶成为基因工程重要的工具酶。Ø根据酶的功能、大小和反应条件，及切割DNA的特点，可以将限制性内切酶分为三类：Ⅰ型酶、Ⅱ型酶、Ⅲ型酶。三种类型限制酶的主要特性差异比较主要特性I型Ⅱ型Ⅲ型限制修饰多功能单功能双功能蛋白结构异源三聚体同源二聚体异源二聚体辅助因

6、子ATP、Mg2+、SAMMg2+ATP、Mg2+、SAM（S-腺苷甲硫氨酸）识别序列TGAN8TGCT旋转对称序列GAGCCCAGCAGAACN6GTGC切割位点距识别序列1kb识别序列内或距识别序列下游处随机性切割附近特异性切24-26bp处割I型限制性内切酶I型酶属复合功能酶，兼具限制、修饰两种功能。核酸内切酶、甲基化酶、ATP酶和DNA解旋酶4种活性。显著特点：识别位点与切割位点不一致。酶分子首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年从大肠杆菌B株和K株分离的。代表：和。识别位点序列未甲基化修饰的特异序列。EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6G

7、TGC作用机理需ATP、Mg2+和SAM(S-腺苷甲硫氨酸)。切割位点在距离特异性识别位点约1000～1500bp处随机切开一条单链。Recognizesitecut1-1.5kbⅢ类限制性内切酶有核酸内切酶和甲基化酶作用。酶分子由两个亚基组成。M亚基负责位点识别与修饰，R亚基具有核酸酶活性。在完全肯定的位点切割DNA，但反应需要ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷甲硫氨酸）。在基因工程操作中用途不大。Ⅱ型限制性内切酶1970年，由H.O.Smith和K.W.Wilco