分子克隆工具酶及其应用

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1、基因工程工具酶及应用工具酶种类限制性内切酶—用于DNA分子的特异切割DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化修饰核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰其它酶类—用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。限制性内切核酸酶Restrictendonuclease细菌限制修饰系统的发现WernerArber于1962-1968年发现，1968年分离到I型限制酶。限制酶HindII的发现Smith和Wilox于1970年首次从流感嗜血杆菌（H.in

2、fluenzae）中发现并分离到HindII限制酶。SV40限制图谱和转录图谱的绘制Nathans（1971年）用HindII绘制SV40的限制酶谱。限制性内切酶的发现历史I型：由三个基因编码，即：hsdR；hsdM；hsdS(hostspecificityforDNArestrictionmodificationandspecificity)位于染色体上，三个基因构成一个复合体(同一操纵子)，限制酶需要ATP、Mg2+、SAM(S-腺苷蛋氨酸)。II型：限制与修饰基因产物独立起作用，在E.coli中这两种基因位于质粒上。III型：修饰酶与I型酶相同，hs

3、dM与hsdS基因产物结合成一亚单位，限制酶是独立存在的。上述三个系统中，只有II型限制酶与甲基化酶具有相当高的核苷酸识别特异性，被广泛用于基因工程中。限制修饰系统的种类定义：广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指II型限制酶。命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。例如：HindIII前三个字母来自于菌种名称H.influenzae，“d”表示菌系为d型血清型；“III”表示分离到的第三个限制酶。EcoRI—EscherichiacoliRIHindIII—HaemophilusinfluensaedIIISacI(II)—Streptom

4、ycesachromagenesI(II)限制性内切酶的定义、命名第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。命名EcoRI属种株序EscherichiacoliRY13株大肠杆菌RY13株的第一种酶识别顺序和酶切位点---识别4~8个相连的核苷酸MboINGATCN；AvaIIGG(A/T)CCBamHIGGATCCNotIGCGGCCGC；SfiIGGCCNNNNNGGCCFokI5’-GGATG(N)9-3’--富含GC限制酶的特点--对称性—双对称EcoRI5’-

5、GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’--切点大多数在识别顺序之内，也有例外--限制酶切后产生两个末端:5’-P和3’-OH3’-端突起PstI5’-CTGCAG-3’5’-CTGCAOHPG-3’3’-GACGTC-5’3’-GPHOACGTC-5’5’-端突起EcoRI5’-GAATTC-3’5’-GOHPAATTC-3’3’-CTTAAG-5’3’-CTTAAPHOG-5’平齐末端SmaI5’-CCCGGG-3’5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’3’-GGGCCC-5’非互补的粘性末端切点在识别顺序之外的，如：FokI5’-GGAT

6、G(N)9-3’5’-GGATG(N)93’-CCTAC(N)13-5’3’-CCTAC(N)13能识别简并顺序的，如：AvaI5’-CPyCGPuG-3’CCCGGG;CTCGGG;CCCGAG;CTCGAG相容性末端如：BamHIGGATCCBglIIAGATCTMboI,Sau3AINGATCN它们产生的DNA片段仍可相连，由此形成的重组分子能被MboI和Sau3AI识别和酶切，但BamHI和BglII的识别机率只有1/16。BamHI和BglII(AGATCT)两种酶产生的相容性末端，相连后不能为两种酶所识别和酶切。定义：能识别相同序列但来源不同的

7、两种或多种限制酶特点：识别相同顺序切割位点的异同KpnIGGTACCAsp718GGTACCSstICCGCGGSacIICCGCGG同裂酶(isoschizomer，异源同序酶)特点:限制酶识别序列特异性降低发生星活性的限制酶和条件(见下一张)星活性的利用和避免限制性内切酶活性单位的定义：1个单位(u)酶指在建议使用的缓冲液及温度下，在20μl反应体系中反应1小时，使1μgDNA完全消化所需的酶量(多数情况下用λDNA来测试)限制酶的星活性(staractivity)表1具有星反应的限制性内切酶与条件限制酶　　　　诱发星活性的条件a识别序列AvaI1,2

8、,4BamHI1-5,8GGATCN,GPuATCCBstI2,4