分子克隆技术的工具酶

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1、第二章分子克隆技术的工具酶1分子克隆的工具酶（instrumentalenzymeofmolecularcloning）是应用于分子克隆中的各种酶的总称，包括核酸序列分析、标记探针制备、载体构建、目的基因制取、重组体DNA制备等所需要的酶类。2用于核酸操作的工具酶限制性核酸内切酶DNA聚合酶DNA连接酶核酸修饰酶3NMPNTPdNMPdNTP45一、限制性核酸内切酶（Restrictionenzyme）核酸酶的分类1）根据核酸底物分RNA酶（Rnase）DNA酶（Dnase）底物非专一性核酸酶；2）根据作用方式分内切核酸酶（endonuclease）外切核酸酶（exonuclease）

2、；3)根据对底物碱基专一性分碱基专一性核酸酶（切割部位的碱基序列高度专一性）非碱基专一性核酸酶（切割部位的碱基序列随机性）6核酸酶能够将核苷酸链的磷酸二酯键切断的酶，属于水解酶。1.限制性核酸内切酶的发现及其生物功能生物功能：识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链；主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵发现：1968年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出HindⅡ和HindⅢ7酵母中的限制性酶：SceI、Endo.SKI限制-修饰系统限制作用：是指一定类型的细菌可以通过限制性核酸内切酶的作用，破坏入侵的外源DNA(如噬菌体DNA等)，使得外源DNA对生物

3、细胞的入侵受到限制；修饰作用：生物细胞(如宿主)自身DNA分子通过甲基化酶的作用，在碱基特定位置上发生了甲基化，可免遭自身限制性内切酶的破坏。限制－修饰作用实际就是细菌中的限制性内切酶降解外源DNA，维护自身遗传稳定的保护机制。8细菌中的防卫系统：限制与修饰现象（1）细菌在其感受态的生理条件下，很容易吸收外源DNA进入体内。这种感受态可以是人为的，也可以是在自然条件下发生的。如果细菌不加限制地接受所有的外源DNA，细菌本身就会很快发生遗传变异甚至死亡。（2）限制性核酸内切酶：可以帮助细菌限制外来DNA的入侵（3）甲基化酶：对该特异位点的碱基进行甲基化修饰，被修饰的DNA就不再被相应的限

4、制酶切割了。（4）细菌自身的DNA——受到甲基化修饰，得以保存（5）外源入侵的DNA——未来得及甲基化，被降解910作为分子克隆宿主菌的大肠杆菌（如DH5α），必须是（1）rec基因缺陷型的突变体，保证必须不与外来DNA分子发生遗传重组；（2）限制系统缺陷或限制与修饰系统均缺陷的菌株，保证外来DNA分子不会受其限制酶的降解。112.限制性核酸内切酶的类型主要特性I型II型III型限制修饰多功能单功能双功能蛋白结构异源三聚体同源二聚体异源二聚体辅助因子ATPMg2+SAMATPMg2+SAMMg2+识别序列TGAN8TGCT旋转对称序列GAGCCAACN6GTGCCAGCAG切割位点距识

5、别序列1kb处识别序列内或附近距识别序列下游随机性切割特异性切割24-26bp处SAM：S-腺苷蛋氨酸12Ⅱ型酶的作用方式在分子克隆中具有十分重要的价值，是分子克隆中常用的工具酶。Ⅰ型酶、Ⅲ型酶的使用不如Ⅱ型酶方便，切割方式不如Ⅱ型酶那样令人满意，在基因克隆中实用价值不大。133.限制性核酸内切酶的命名属名种名株名HindⅢHindⅡHaemophilusinfluenzaed嗜血流感杆菌d株同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶14H：细菌属名的头一个字母in：细菌种名的头两个字母Hin：表示了该菌的物种名称，用斜体d：代表该菌菌株名称III：表示该菌具有几个不同的限制与修饰体系

6、，Ⅲ表示该酶是属于第三个限制修饰系统的酶154.II型限制性核酸内切酶的基本特性（1）识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列；（2）大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧；（3）识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构；5‘…GCTGAATTCGAG…3’3‘…CGACTTAAGCTC…5’EcoRⅠ的识别序列EcoRⅠ的切割位点16（1）回文结构（palindrome）序列正读和反读是一样的，即有一个中心对称轴，从这个轴朝两个方向读序列是完全一样的。在切割位点处，限制性核酸内切酶的作用下磷酸二酯键会发生水解效应，从而导致链的断裂。17（2）限制性核酸内切酶的切割类型：粘末端：两条链

7、上的断裂位置是交错和对称围绕着一个对称轴排列，这种形式的断裂结果形成具有粘末端的DNA片段；平末端：两条链上的断裂位置是处在一个对称轴的中心，这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片段。18EcoRⅠ等产生的5’粘性末端5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRⅠ37℃5‘…G-C-T-G-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-