分子克隆工具酶-13级

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1、第三章分子克隆工具酶第一节限制性内切酶第二节甲基化酶第三节DNA聚合酶第四节其他分子克隆工具酶第一节限制性内切酶一、限制与修饰二、限制酶识别的序列三、限制酶产生的末端四、线性DNA末端对酶切的影响五、酶切反应条件六、酶切位点的引入一、限制与修饰细菌的限制与修饰系统(R/M系统)由限制酶（限制性核酸内切酶）和修饰酶（甲基化酶）组成。R/M系统的作用：保护自身的DNA不受切割；破坏外源DNA使之迅速降解。λ噬菌体在不同宿主中的转染频率。（见p17）实验说明：K菌株和B菌株中存在一种限制作用，可排除外来的DNA.限制酶降解外源DNA，维护宿主遗传

2、稳定的保护机制识别自身遗传物质和外来遗传物质A→N6-MeAC→5'-MeC限制酶的发现美国约翰.霍布金斯大学的H.Smith于1970年偶然发现，流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)能迅速降解外源的噬菌体DNA，其细胞提取液可降解E.coliDNA，但不能降解自身DNA，从而找到HindII限制性内切酶。限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease)是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的脱氧核糖核酸内切酶。限制酶的生物学功能用来保护宿主不受外来DNA的感染，可降解

3、外来的DNA，从而阻止其复制和整合到细胞中。限制酶的种类Ⅰ型酶(种类很少，只占1%)三亚基双功能酶，分子量较大，反应需Mg2+、ATP有特异识别位点但没有特异切割位点Ⅱ型酶(占90%以上)分子量较小，反应只需Mg2+；识别位点是一个回文对称结构，切割位点在回文对称结构上；多数Ⅱ型酶切割DNA后形成粘性末端Ⅲ型酶(种类更少，不到1%)二亚基双功能酶，能识别特定顺序，在该顺序的3’端24~26bp处切开DNA，切割位点没有特异性。限制酶的命名原则第1个字母：大写，来自微生物属名第1个字母第2和3字母：小写，来自微生物种名前两个字母其它字母：大写

4、或小写，来自微生物菌株号罗马数字：该菌株发现的限制酶的编号例：EcoRI来源于EscheriacoliRY13的第一个限制酶，其识别序列为：GAATTC；二、限制酶识别的序列识别序列的长度一般为4~8个碱基，最常见的为6个碱基.4bp识别序列：Sau3AI↓GATC5bp识别序列：EcoRⅡ↓CCWGG(W=A/T)6bp识别序列：EcoRⅠG↓AATTC7bp识别序列：BbvCICC↓TCAGC8bp识别序列：NotIGC↓GGCCGC当DNA中可识别的序列在完全随机的情况下：识别序列为4个碱基时，平均每256个(44)碱基中会出现一个识

5、别位点；识别序列为6个碱基时，平均每4096个(46)碱基中会出现一个识别位点。识别序列的结构大多数为回文对称结构，切割位点在DNA两条链相对称的位置。限制酶切割的位置大多数在识别序列的内部，如EcoRI、SmaI等；但也有在外部的：有两端、两侧和单侧之分，如Sau3AI(↓GATC)。三、限制酶产生的末端限制酶产生黏性末端在对称轴5´侧切割底物，DNA双链交错断开产生5´突出黏性末端，如EcoRI；在3´侧切割，则产生3´突出黏性末端，如PstI；限制酶产生平末端在回文对称轴上同时切割DNA两条链，产生平末端，如HpaⅠ。限制酶产生非对称

6、突出末端当识别序列为非对称序列时，切割的DNA产物的末端是不同的，如BbvCⅠ的识别切割位点如下：CC↓TCAGCGGAGT↑CG同裂酶：识别相同序列的限制酶称为同裂酶。同序同切酶：识别序列和切割位置都相同HpaⅡ与MspⅠ识别切割位点为C↓CGGMobⅠ与Sau3AⅠ识别切割位点为↓GATC同序异切酶：识别序列相同，但切割位点不同KpnⅠ：GGTAC↓CAcc65Ⅰ：G↓GTACC“同工多位”酶：识别简并序列的限制酶包含了另一种限制酶的功能。EcoRI：G↓AATTCApoI:R↓AATTY(R=A/GY=C/T)同尾酶可产生相同的黏性突

7、出末端的酶统称为同尾酶。同尾酶切割DNA得到的产物可进行互补连接。EcoRⅠ：G↓AATTCApoI:R↓AATTYMfeI:C↓AATTC稀切酶有较长的识别序列和富含GC或AT的识别序列的限制酶称为稀切酶。在基因操作中使用稀切酶可以获得大的片段。四、线性DNA末端对酶切的影响DNA末端长度的影响限制酶切割DNA时，识别序列两端必须有一定数量的核苷酸，否则难以发挥切割活性。一般在识别序列末端有3~4个碱基对时能满足常规的酶切需要。位点偏爱(sitepreference)某些限制酶对不同位置的同一识别序列表现出不同的切割效率，这种现象称作位点

8、偏爱。pBR322质粒上有4个NarⅠ位点，在标准条件下1单位NarⅠ可在1h内将2个位点完全切割，但另外2个位点在50单位16h内也不能切割完全。造成位点偏爱的原因在切割DNA