《分子克隆工具酶》PPT课件

《《分子克隆工具酶》PPT课件》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、基因工程田长恩Tel:13342886615基因工程1基因工程概论2天然DNA的制备3分子克隆工具酶4分子克隆载体5表达载体6PCR技术及其应用7基因文库的构建8基因克隆的筛选策略10细菌基因工程11酵母基因工程12植物基因工程13动物基因工程14基因工程的安全9转基因及其表达3分子克隆工具酶3.1限制性核酸内切酶与DNA切割概念：（restrictionendonuclease）一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶(endo-deoxyribonuclease)。生物学意义：是生物细胞内限制性修饰系统的一部分，可防止外源DNA的入侵（图）。生

2、物在长期的演化过程中，含某种限制性核酸内切酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制性核酸内切酶的识别序列，或者通过甲基化酶把甲基转移到识别序列的碱基上，保护相应序列不被酶切割。分布：细菌、少数霉菌和蓝藻中也有。类型：即I、II和III型酶，各具特性(表)。分子生物学和基因工程操作中用的是II型酶。PhageinjectsDNAintoE.coliREbindstophageDNAPhageDNAiscleavedREcannotbindstorecognitionsequenceRecognitionsequencearemethylatedE.coliDNATherestrictionan

3、dmodificationsysteminE.coli命名：以酶的来源生物的属名和种名的第1、2个字母以及菌株（型）的代号来命名。如果从同一生物中先后提取到多种限制性核酸内切酶，则依次用罗马数字表示。例如，从HaemophilusinfluenzaeRd中提取到的第三种限制性核酸内切酶被命名为HindIII。作用机制：以环状和线形的双链DNA为底物，在合适的反应条件下，识别特定的核苷酸序列，使两条核糖核苷酸链上特定位置的磷酸二酯键断开，产生具有3’-OH基团和5’-P基团的片段(图)。黏性(突出)末端的产生内切酶造成DNA分子的断裂类型（i）黏性（突出）末端:两链的断裂位置交错、对称地绕着一个

4、对称轴排列所形成的断裂。（ii）平末端：两条链上的断裂位置处在一个对称结构的中心所形式的断裂。II型限制性核酸内切酶的基本特性与I及III型限制酶不同，II型酶只有一种多肽，并常以同源二聚体存在，具三个基本特性：（i）在DNA双链的特异识别序列切割DNA，产生断裂；（ii）通常2个单链断裂部位在DNA分子上不直接相对；（iii）因此，断裂形成的片段往往具有互补的单链延伸末端。识别序列：能识别的核酸链上特殊的核苷酸序列。绝大多数的II型酶的识别序列由4～8个特定的核苷酸组成，其中以6个为多。II型酶从识别序列内切割DNA，识别序列多连续(如GATC），少间断（如GANTC），其共同特点是，双重旋

5、转对称的结构形式，即回文结构(图).切割位点就旋转对称轴而言位于对称的位置。产生黏性末端有两类：3’-OH;5’-P。3’-OH5’-PDNA的识别序列数：在随机排列的DNA中，由n个核苷酸组成的内切酶识别序列出现一次的概率为4n。有的限制酶识别序列包含在另一种限制酶识别之内(如Sau3AI：GATC；BamHI：GGATCC)。识别序列的多样化：一些限制酶能识别多种核苷酸序列，如HindII。同裂酶：识别序列相同而来源不同的酶(isoschizomer)。同裂酶的用途：有些同裂酶对碱基甲基化的敏感性不同，可用来研究DNA甲基化作用。例如，HpaII和MspI的靶子是CCGG。当靶序列中有5-

6、甲基胞嘧啶（C*CGG，*：甲基化碱基）时，HpaII不能切割，而MspI能切割。同尾酶：来源和识别序列各不相同，但产生出相同粘性末端的酶（isocaudamer）。如BamHI、BclI、BglII、Sau3AI和XhoII，产生粘性末端GATC。同尾酶用途：同尾酶产生的粘性末端，能够通过之间的互补作用而彼此连接。由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点，特称之为“杂种位点”（hybridsite），一般不能再被原来的任何一种酶所识别，不过亦有例外（表）。U：Pu，嘌呤；Y：Py，嘧啶影响限制性核酸内切酶活性的因子DNA的纯度：消化速率取决于DNA的纯度。DNA制剂的污染物有蛋白、酚

7、、氯仿、酒精、EDTA、SDS、以及盐离子等，都可能抑制制酶活。解决途径①增加酶量，每微克DNA可高达10单位或以上。②扩大反应体积，以稀释抑制因素。③延长反应时间。④提高纯度。⑤加入聚阳离子亚精胺(终浓度为1~2.5mmol/L)。DNA的分子结构:构型影响酶活，某些酶切割超螺旋的质粒或病毒DNA所需要的酶量要比消化线性DNA的高许多倍，最高可达20倍。侧翼序列：a大多限制酶只对两侧存在侧翼序列