百合病毒多重rt—pcr检测技术

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1、百合病毒多重RT—PCR检测技术　　摘要：根据百合（Liliumbrowniivar.viridulum）常见的黄瓜花叶病毒（CMV）、百合斑驳病毒（LMoV）、无症病毒（LSV）引物序列，设计2组特异引物，以18SrRNA为内参基因，采用多重RT-PCR，2组引物均能扩增得到LMoV和LSV预期大小一致的片段，未检测到CMV，检测结果不受病株取材部位的影响。该方法的建立为百合脱毒苗的规模化生产提供了高效检测技术。关键词：百合（Liliumbrowniivar.viridulum）；病毒；多重RT-PCR中图分

2、类号：S682.2文献标识码：A文章编号：0439-8114（2013）20-5051-03StudiesonMultiplexRT-PCRDetectiononVirusesofLilyZOUYing-chun1，2，YANGChao-zhu2，QINDa-ji1，2，ZHAOQing-hua2，XIANGJi-qian1，2，YINHong-qing1，2，YANGYong-kang1，2，HUANGJian-min1，2，PILei1，2（1.EnshiQingjiangBio-EngineeringCo

3、.，Ltd.，Enshi445000，Hubei，China；2.WestComprehensive7ExperimentStationofHubeiProvincialAgricultureS&TInnovationCenter，Enshi445000，Hubei，China）Abstract：Basedontheprimersdetectinglily（Liliumbrowniivar.viridulum）cucumbermosaicvirus（CMV），lilymottlevirus（LMoV）andli

4、lysymptomlessvirus（LSV），twogroupsofspecificprimersweredesigned.Using18SribosomalRNAasinternalcontrolgene，multiplexRT-PCRmethodwereestablishedtodetectthe3majorviruses.LMoVandLSVweredetected，butCMVwasnotdetected.Thisdetectingmethodwillpromotethelarge-scaleprod

5、uctionofthevirus-freelilyseedling.Keywords：lily（Liliumbrowniivar.viridulum）；virus；multiplexRT-PCR百合（Liliumbrowniivar.viridulum）是百合科百合属多年生草本球根植物，主要分布在亚洲东部、欧洲、北美洲等北半球温带地区。我国栽培的百合种球主要依赖进口，长期的无性繁殖导致优良品种种球带毒严重，部分病毒感染率高达60%[1]。目前，国内外已报道侵染百合的病毒有20余种，其中黄瓜花叶病毒（Cucumb

6、ermosaicvirus，CMV）、百合斑驳病毒（Lilymottle7virus，LMoV）和百合无症病毒（Lilysymptomlessvirus，LSV）是目前危害最大的3种主要病毒，它们单独和混合侵染可造成百合切花与鳞茎品质和产量的严重下降[1-5]。对这3种病毒的检测成为种球质量评估的关键，也是后续的分球和组培生产脱毒苗关键技术[6-9]。目前，常见的百合病毒检测方法有电子显微镜法、血清学方法、分子杂交、反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、血清学和PCR相结合的方法以及基因芯片法等。其中，RT-P

7、CR方法被证实是目前特异性最强、灵敏度最高的病毒检测方法，现已广泛应用于病原诊断和检测。而后来发展起来的多重RT-PCR（multiplexRT-PCR）可以一次检测多种病毒，特异性强，灵敏度高，成为百合等常年无性繁殖作物病毒的高效检测方法。近年来湖北省恩施州百合产业发展较快，引进了不少国内外品种，但病毒的检测仍依赖于异地检测。因此，本研究旨在建立百合病毒的多重RT-PCR检测技术，为湖北省恩施州百合产业发展和脱毒种球种苗生产以及疫病监控提供技术支撑。1材料与方法1.1材料7百合病株样本采集自湖北省恩施州双河高

8、山培育基地，均为从荷兰引种的种球种植而成。病株采集参照徐秉良等[10]描述，主要表现为叶片黄斑，凹凸，扭曲，褐化，深绿色斑点，花的症状为褐色斑点，植株症状为矮化。1.2试剂植物总RNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，5×M-MuLV反转录酶缓冲溶液、M-MuLV反转录酶、10×TaqReactionBuffer、TaqDNAPolymerase均购自Promega公司，dN