国境口岸轮状病毒(a组)、诺沃克病毒、星状病毒的多重rt-pcr检测方法

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1、国境口岸轮状病毒(A组)、诺沃克病毒、星状病毒的多重RT-PCR检测方法编制说明（征求意见稿）目录1工作概述21.1任务来源21.2制定本标准的目的和意义21.3国内外有关标准的简要说明32标准的制定基础33标准方法研制过程43.1材料来源43.2方法建立43.2.1方法建立的技术路线和过程43.2.2引物设计和优化53.2.3多重RT-PCR反应条件的优化53.2.4灵敏度实验63.2.5大样本的评价实验74方法的验证85建议86参考文献和标准87附件97.1广东出入境检验检疫局验证报告97.2厦门国际旅行卫生保健中心验证报告107.3广州市妇女儿童医

2、疗中心验证报告11111工作概述1.1任务来源本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口。本标准由国家质量监督检验检疫总局批准。计划编号：2011B175类别：卫生检疫标准名称：国境口岸轮状病毒(A组)、诺沃克病毒、星状病毒的多重RT-PCR检测方法负责起草单位：中华人民共和国珠海出入境检验检疫局本标准主要起草人：莫秋华、谭华、李卫岗、梁玉英、史咏梅、杨泽、涂承宁1.2制定本标准的目的和意义本标准以国境口岸腹泻病人为检测对象，针对轮状病毒（A组）、诺沃克病毒和星状病毒等3种最主要的病毒性腹泻病原体，制订一管反应能同时检测3种病毒的多重RT-PCR快速检测

3、方法，以满足口岸卫生检疫部门开展腹泻病监测和防控的需要，并能提高检测工作的效率，缩短检测时间。腹泻病（DiarrheaDiseases）是一组多病原、多因素引起的疾病，目前它已成为严重影响人类健康的一个重要公共卫生问题。世界卫生组织（WHO）20世纪90年代的统计结果显示：全世界5岁以下婴幼儿，每年有10亿患腹泻，可导致500万小儿死亡。在第三世界国家，腹泻病是造成幼儿死亡的第一原因。在中国，腹泻病是仅次于呼吸道疾病的第二位多发病，也是婴幼儿死亡的两大病因之一。我国卫生部早已把腹泻病列为儿科重点防治的疾病之一。腹泻病分为感染性腹泻和非感染性腹泻两大类，其

4、临床表现轻重不等，多表现为腹痛、腹泻、呕吐、发热等症状，严重者还伴有脱水、电解质紊乱甚至休克、死亡。在感染性腹泻病中，11目前已知引起腹泻的病原体有数十种之多，但国内报告以细菌性和病毒性腹泻占多数。虽然不同自然环境和生产、生活方式不同的地区，引起腹泻病的主要病原体有所不同，但总体上居首位的是志贺氏菌及轮状病毒。病毒性腹泻在感染性腹泻中占有重要的比例，轮状病毒(Rotavirus，RV)、诺沃克病毒（Norwalkvirus,NVs）和星状病毒（Astrovirus，AVs）等3种胃肠炎病毒是主要的病原体。它们均是RNA病毒，通过水、食物等途径在儿童和成人

5、中引起急性胃肠炎的散发和暴发，甚至大流行,如2008年初在英国出现的诺沃克病毒大暴发，每周约有10万人感染该病毒，严重影响人们健康和社会发展。在国境口岸针对出入境可疑胃肠炎发病人员的查验工作中，在应对可能的突发公共卫生事件中，均迫切需求能快速检出致病病原体的检测方法。基于RT-PCR的分子生物学技术是病毒检测首选的方法。如果采用一次实验能同时检出以上3种常见腹泻病病毒的多病原体联检技术，即所谓多重（3重）RT-PCR技术，将能大大加快检测的速度，提高工作效率，节省试剂成本，对于防止急性胃肠炎的暴发、大流行，保障人民健康，做好公共卫生工作都具有重要意义。1

6、.3国内外有关标准的简要说明截止2012年7月，经检索，目前没有相关行业标准涉及多重RT-PCR检测方法通过一次实验同时检测轮状病毒、诺沃克病毒和星状病毒等3种病毒。具体来说，目前已颁布或尚在制订中的检验检疫行业标准均只涉及到以上3种病毒中的某一种的检测，并且主要为食品专业的标准，卫生检疫专业的较少。列举如下：目前涉及以上3种病毒的相关检验检疫行业标准，已颁布实施的有6项，其中4项是食品专业（分别是：SN/T2520-2010贝类中A群轮状病毒检测方法普通PCR和实时荧光PCR方法；SN/T1635-2005贝类中诺沃克病毒检测方法普通RT-PCR方法和

7、实时荧光RT-PCR检测；SN/T2730-2010进出口食品中诺如病毒检测酶联免疫吸附法；SN/T2519-2010贝类中星状病毒检测方法普通PCR和实时荧光PCR方法），另2项是卫生检疫专业（分别是：SN/T1720-2006出入境口岸轮状病毒感染监测规程；SN/T2626-2010国境口岸诺如病毒检测方法）；仍在制修订当中的计划项目有1项（属于卫生检疫专业）：2009B229口岸食源性疾病轮状病毒（A组）荧光PCR检测方法。2标准的制定基础本标准制订单位是国家质检总局批准设立的“国家级腹泻病检测重点实验室”11，长期在腹泻病领域开展检测和科学研究工

8、作。实验室在2009年承担了1项珠海市科技计划项目—“基于等温扩增的三种致腹泻重