SN∕T 5105-2019 国境口岸轮状病毒（B组）实时荧光RT-PCR检测方法

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1、犐犆犛１１．０２０犆６２中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜５１０５—２０１９国境口岸轮状病毒（犅组）实时荧光犚犜犘犆犚检测方法犇犲狋犲犮狋犻狅狀犿犲狋犺狅犱狅犳犚狅狋犪狏犻狉狌狊（犵狉狅狌狆犅）犫狔狉犲犪犾狋犻犿犲犳犾狌狅狉犲狊犮犲狀犮犲犚犜犘犆犚犪狋犳狉狅狀狋犻犲狉狆狅狉狋狊２０１９０９０３发布２０２００３０１实施中华人民共和国海关总署发布犛犖／犜５１０５—２０１９前言本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。本标准起草单位：中华人

2、民共和国拱北海关、中华人民共和国厦门海关、中华人民共和国深圳海关、深圳市计量质量检测研究院。本标准主要起草人：莫秋华、杨坤宇、杨泽、汪海波、史蕾、陈晶、陈新彬、吴锦顺、涂承宁、史咏梅、杨国武。Ⅰ犛犖／犜５１０５—２０１９国境口岸轮状病毒（犅组）实时荧光犚犜犘犆犚检测方法１范围本标准规定了国境口岸成人腹泻轮状病毒（Ｂ组）实时荧光ＲＴＰＣＲ检测的对象、检测方法及结果报告。本标准适用于国境口岸成人腹泻轮状病毒（Ｂ组）的实验室检测。２规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注

3、日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ１９４８９实验室生物安全通用要求ＳＮ／Ｔ１７２０出入境口岸轮状病毒感染监测规程ＷＳ／Ｔ２３０临床诊断中聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术的应用人间传染的病原微生物名录（原中华人民共和国卫生部）３术语和定义下列术语和定义适用于本文件。３．１轮状病毒狉狅狋犪狏犻狉狌狊属于呼肠孤病毒科（犚犲狅狏犻狉犻犱犪犲）轮状病毒属（犚狅狋犪狏犻狉狌狊），为双链ＲＮＡ病毒，基因组分１１个节段，是引起人类、哺乳动物类和鸟类腹泻的主要病原体。轮

4、状病毒有７个血清组（Ａ～Ｇ），其中Ａ、Ｂ、Ｃ组能引起人和动物腹泻。Ａ组轮状病毒最常见，它是婴幼儿腹泻首要的致病原。Ｂ组轮状病毒感染对象没有年龄限制，主要感染１５—４５岁的青壮年，但也可感染老人和婴幼儿，故又定名为成人腹泻轮状病毒（ａｄｕｌｔｄｉａｒｒｈｅａｒｏｔａｖｉｒｕｓ，ＡＤＲＶ）。３．２逆转录聚合酶链反应狉犲狏犲狉狊犲狋狉犪狀狊犮狉犻狆狋犻狅狀狆狅犾狔犿犲狉犪狊犲犮犺犪犻狀狉犲犪犮狋犻狅狀；犚犜犘犆犚将ＲＮＡ的逆转录（ＲＴ）和ｃＤＮＡ的聚合酶链式扩增（ＰＣＲ）相结合的技术。本标准采用一步法逆转录聚合

5、酶链式反应（ＲＴＰＣＲ）。在一步法ＲＴＰＣＲ中，首先以ＲＮＡ为模板，利用下游特异性引物，在依赖ＲＮＡ的ＤＮＡ聚合酶（逆转录酶）的作用下转录合成互补ＤＮＡ（ｃＤＮＡ），该步称作“逆转录”：随后，再以ｃＤＮＡ为模板，利用上游和下游特异性引物，在ＤＮＡ聚合酶的作用下进行ＰＣＲ循环扩增；最终使ＲＮＡ分子的某个特定区域（目的片段）被扩增达几百万倍。３．３实时荧光犚犜犘犆犚狉犲犪犾狋犻犿犲犳犾狌狅狉犲狊犮犲狀犮犲犚犜犘犆犚通过荧光染料或荧光标记的特异性荧光探针，对反转录后ＰＣＲ扩增的产物进行标记跟踪，利用荧光

6、信号累积实现实时在线监测整个ＰＣＲ反应过程，结合相应的软件可以对结果进行定性和定量分析。１犛犖／犜５１０５—２０１９本标准所采用的荧光探针是分子信标（ｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｅａｃｏｎ）探针。分子信标探针是一种荧光标记的寡核苷酸链，一般含有２５～３５个核苷酸。在结构上，分子信标探针可以分为三部分，即环状区、茎干区、荧光基团和淬灭基团。环状区：一般由１５～３０个核苷酸组成，可以与靶分子特异结合；茎干区：寡核苷酸链两端的核酸序列互补配对形成的５～８个碱基对的ＤＮＡ双链结构，在分子信标与靶分子结合过程中可发生可逆性解

7、离；荧光基团和淬灭基团：荧光报告基团（如ＦＡＭ）一般连接在５’端，荧光淬灭基团（如Ｄａｂｃｙｌ）一般连接在３’端。自由状态时的分子信标呈发夹结构，此时由于荧光基团与淬灭基团靠得很近，荧光被淬灭；当与靶序列结合后，分子信标的空间构型发生改变，使荧光基团与淬灭基团距离变大，分别位于伸展开的探针的两端，荧光得以恢复。分子信标技术具有很高的特异性，而且操作简便、灵敏度高，特别是它可以进行实时定量检测，甚至可以用于活体分析。３．４犆狋值犆狔犮犾犲狋犺狉犲狊犺狅犾犱在荧光ＰＣＲ中，每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时

8、所经历的循环数。４缩略语下列缩略语适用于本文件。ＤＥＰＣ：焦碳酸乙二酯（ｄｉｅｔｈｙｌｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）ＰＡＧＥ：聚丙烯酰胺凝胶电泳（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）ＨＰＬＣ：高效液相色谱（ｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）ｂｐ：碱基对（ｂａｓｅｐａｉｒ）ＦＡＭ：６羧基一荧光素（６ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）ＤＡＢＣ