SN∕T 5096-2019 国境口岸蜱传孤星病毒实时荧光RT-PCR检测方法

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1、ICS11.020C62中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T5096—2019国境口岸蜱传孤星病毒实时荧光RT-PCR检测方法Real-timeRT-PCRmethodfordetectingLoneStarvirusinticksatfrontierports2019-09-03发布2020-03-01实施中华人民共和国海关总署发布孤星病毒.indd12019/9/1214:00:53孤星病毒.indd22019/9/1214:00:53SN/T5096—2019前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本

2、标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、杭州富集生物科技有限公司、中华人民共和国呼和浩特海关。本标准主要起草人：刘丽娟、曹晓梅、马爱敏、胡孔新、杨宇、徐宝梁、郭天宇、张胜、王静。I孤星病毒.indd12019/9/1214:00:53孤星病毒.indd22019/9/1214:00:53SN/T5096—2019国境口岸蜱传孤星病毒实时荧光RT-PCR检测方法1范围本标准规定了国境口岸蜱传孤星病毒实时荧光RT-PCR检测方法的检测对象、生物安全和PCR防污染要求、仪器、试剂和检验程序。本标

3、准适用于对蜱传孤星病毒的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求SN/T1293国境口岸蜱类监测规程WS/T230临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用人间传染的病原微生物名录（中华人民共和国卫生部卫科教发〔2006〕15号）3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1孤星病毒LoneStarvirus；LSV布尼亚病毒科白蛉病毒属成员，是单股负链节段

4、性RNA病毒，有S、M和L片段。其中，L片段编码RNA依赖性RNA多聚酶，M片段编码糖蛋白Gn和Gc，S片段编码核衣壳蛋白和非结构蛋白。孤星病毒主要经蜱传播，经蜱叮咬后，人可能出现蜱传斑点热等症状。4缩略语下列缩略语适用于本文件。bp：碱基对（basepair）Ct值：循环阈值（cyclethreshold）DEPC：焦碳酸乙二酯（diethylpyrocarbonate）FAM：6-羧基-荧光素（6-carboxy-fluorescein）RNA：核糖核酸（ribonucleicacid）ROX：6-羧基-x-罗丹明（6-ca

5、rboxy-x-rhodamine）RT-PCR：逆转录聚合酶链反应（reversetranscriptionpolymerasechainreation）1孤星病毒.indd12019/9/1214:00:53SN/T5096—20195检测对象5.1国境口岸现场采集的蜱虫样本。5.2疑似被蜱虫叮咬且不能排除孤星病毒感染的人员。6生物安全和PCR防污染要求6.1生物安全要求按照GB19489和《人间感染的病原微生物名录》的要求，孤星病毒相关材料的生物安全要求如下：——未经培养的孤星病毒感染性材料的操作应在生物安全二级（BSL-

6、2）实验室内进行；——孤星病毒相关的灭活材料和无感染性材料操作可在生物安全一级（BSL-1）实验室内进行；——孤星病毒感染性材料运输和包装分为B类，UN编号为UN3373。6.2PCR防污染要求PCR防污染措施按WS/T230的规定执行。7仪器7.1荧光定量PCR仪。7.2二级生物安全柜。7.3高压灭菌器。7.4-70℃超低温冰箱。7.5冷冻离心机。7.6旋涡振荡器。8试剂8.1DEPC水DEPC处理过的不含RNA酶的水。8.2RNA提取试剂盒1）aQIAampViralRNAkit，详见试剂盒说明书，内含AVL、AW1、AW2

7、和AVE等。8.3一步法荧光RT-PCR试剂盒TM2）bAg-Path-IDOnestepRT-PCRKit。1）　给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。2）　给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。2孤星病毒.indd22019/9/1214:00:53SN/T5096—20198.4引物和探针序列见表1。表1引物和探针序列引物/探针名称序列（5’-3’）监测期FCTTCCT

8、TAACCCTCAGATARCCTCTTTATGGTCCCTTA扩增片段为134bpProbeFAM-TCATCAACATCTCGTCTCATTCGCT-BHQ1注：探针的5’端标记的是FAM荧光报告基团，3’端标记的是BHQ1荧光淬灭基团。其他等效荧光标记物和