流感病毒rna荧光rt-pcr检测技术

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1、流感病毒RNA荧光RT-PCR检测技术实吋荧光定量PCR是在常规PCR基础上发展起来的定量PCR技术，通过在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积，实时监测整个PCR进程，最后根据ct值和标准曲线，对未知模版进行定量分析。常用的实时荧光定量PCR又分为非特异性荧光标记的SYBRGreen法和特异性荧光标记的TaqMan法和分子信标法。一、实时荧光定量PCR原理：1、SYBRGreen法：SYBRGreen是一种双链DNA结合染料，游离状态下不发光，非特意地掺入到双链DNA+后发出荧光信号，其强度与双链

2、DNA的数暈相关，随着扩增产物暈的增加，检测到的荧光信号增强。2^TaqMan法：在扩增反应液屮，加入一特异性探针，该探针5'端和3'端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团，探针完整时，两基团位置靠近，5'端报告基团的荧光能量被3'端淬灭基团吸收，此时检测不到荧光信号，在扩增过程屮，探针与模板结合形成Taq酶的5'-3,外切活性底物，当Taq酶沿模板向前延伸到探针结合处吋，发生链的置换，Taq酶的5'-3'外切活切将探针5'端连接的报告基团从探针上切割下來，5'端报告基团的荧光能量脱离3'端荧光淬灭基团

3、的吸收，可检测到荧光信号，每经过一个PCR循坏，荧光信号也和扩增产物一样，有一个同步增长的过程。3、分子信标法：探针设计成茎环结构的发夹状，环部核昔酸序列与扩增产物序列互补，两端核昔酸序列互补形成茎部，且一端标记有报告基团，另一端标记有淬灭基团，探针未与模板结合时，报告基团和淬灭基团空间位置靠近，报告基团的荧光能量被淬灭基团吸收，此时，检测不到荧光信号，与模板结合后，探针的构象由发夹状改变为链状，报告基团和淬灭基团分离，可检测到荧光信号。核酸检测是一种鉴定流感病毒基因组的有力方法，即使基因组含量很低或死病毒也

4、可以检测到。木章将介绍检测流感病毒的聚合酶链式反应（PCR）o流感病毒的基因组是负链RNA,在进行PCR扩增前必须合成与病毒RNA互补的DNA,即为cDNA。逆转录酶（RT）就是用于合成cDNA的多聚酶，因此，扩增流感病毒基因组的过程称为RT・PCR。RT-PCR需要--对型别特异引物，四种脫氧核昔酸（dNTPs）,RNA模板,逆转录酶及TaqDNA多聚酶；首先由逆转录酶将病毒的RNA逆转录合成cDNA,然后再进行聚合酶链反应经25〜30个循环，使DNA产物达到倍增的效果。二、试剂器材设备和器械咽拭子液的配制

5、:一瓶MEM液500ml,+8万单位庆大1.25ml,分装在5ml小管中,每管4ml。小管最好高压。1、RNA提取试剂盒荧光PCR检测试剂盒提収试剂盒组分：洗脱液(ElutionBuffer)、载体核酸(CarrierRNA)、裂解结合增强液(Lysis/BindingEnhance)、裂解/结合液(Lysis/BindingSoln)、磁珠(RNABindingBeads)、洗涤液1(WashSoln1)、洗涤液2(WashSoln2)荧光PCR检测试剂盒组分：2XRT-PCR反应液(2XRT・PCRBuf

6、fer)、25XRT-PCR酶混合液(25XRT-PCREnzymeMix)>高G/C含量引物/探针检测增强剂(DetectionEnhancer)>无核酸降解酶的水(Nuclease-freeWater)无水乙醇无水异丙醇2、生物安全柜移液器微型离心机微型漩涡式混合器微型离心管PCR管冷冻盒带滤头吸头低温冰箱U型样品处理板96孔磁力板三、操作步骤一.样本的处理(在样本处理区进行)根据咽拭子标本数，计算好所需配制的裂解液和磁珠混合液的暈，即待测样本数+阴性对照+甲型对照+乙型对照+—个样本量为损耗。需要配制的

7、液体仅仅是洗液：洗液1：向WashSolnCone.1瓶中加入12毫升无水异丙醇(100%)。摇匀后室温保存；洗液2：向WashSolnCone.2瓶中加入32亳升无水乙醇(100%)。摇匀后室温保存。将含拭子的转运液震荡2分钟，取50微升上清液进行核酸抽提。剩余溶液・80°C保存。1.配制裂解/结合液每反应lulCarrierRNA,每反应65ulLysis/BingingCone.,每反应65ul无水异丙醇。摇匀后室温保存备用。2.配制磁珠混合液每反应10ulLysis/BingingEnhance,每反

8、应10ulRNAbindingBeadso混匀后4°C保存备用。3.裂解/结合U型板中顺次加入20ul磁珠混合液、50ul预处理后的样品、130"裂解/结合液。漩涡振荡器上轻微振荡5分钟，完成溶液混匀和核酸结合。将U型板移至96孔磁力板上，静置3分钟。将U型板保持在磁力板上，移去上清液。4.洗涤液1洗涤2次：将U型板从磁力板上拿下，加入150微升洗涤液1,漩涡振荡30秒将U型板移至96孔磁力板上，静