人乳头瘤病毒E6E7基因重组腺病毒构建论文.doc

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1、人乳头瘤病毒E6E7基因重组腺病毒构建论文【摘要目的摘要：利用AdEasy系统构建人乳头瘤16(HPV16)E6E7基因重组腺病毒，并通过WesternBlot方法检测E6E7蛋白的表达.方法摘要：将质粒pET32a（+）E6E7扩增、酶切获得E6E7片段插入腺病毒穿梭载体质粒pAdTrackCMV的巨细胞病毒（CMV）启动子下游，构建重组穿梭载体pAdTrackCMVE6E7，线性化后和骨架载体AdEasy1在细菌BJ5183内同源重组得到腺病毒质粒pAdE6E7，经人胚肾293细胞包装后得到复制缺陷型重组腺病毒AdE6E7；

2、用包装后的病毒上清再次感染293细胞，提取细胞中的蛋白，通过WesternBlot方法检测E6E7蛋白的表达.结果摘要：连接、重组后通过酶切和测序法筛选出pAdE6E7；经人胚肾293细胞包装，3d后观察到绿色荧光蛋白（GFP）明显表达，氯化铯梯度离心纯化最终获得6.9×1010pfu/L滴度的重组病毒；用该滴度的AdE6E7重新感染人胚肾293细胞3d后，提取细胞蛋白,WesternBlot检测,E6E7有明显表达.结论摘要：利用新型腺病毒载体AdEasy系统可在短期内制备同时表达GFP和E6E7的重组腺病毒AdE6E7.【人

3、类乳头状瘤病毒，人；腺病毒科0引言高危型人类乳头瘤状病毒（HPV16,18）和宫颈癌的发病密切相关［1］.HPV编码了多种癌蛋白（E1,E5,E6,E7等）其中以E6,E7为主，他们都能诱导细胞永生化，引起细胞的永生.复制缺陷型重组腺病毒(replicationdeficientrecombinantadenovirus)是目前基因治疗最常用的载体之一［2］，我们利用AdEasy系统构建了外源插入HPV16E6E7片段的复制缺陷性腺病毒AdE6E7，并观察了AdE6E7感染293细胞，为探究HPV16E6E7在女性宫颈癌中的功能

4、提供新的手段.1材料和方法1.1材料穿梭质粒pAdTrackCMV，骨架质粒pAdEasy1，仅插入GFP的对照重组腺病毒质粒pAdGFP，大肠杆菌BJ5183由重庆医科大学肝病探究所惠赠；293细胞、E.coli,DH5a由本实验室保存.pET32a（+）E6E7载体已构建成功.PmeⅠ,PacⅠ限制性内切酶购自基因公司；BglⅡ,HindⅢ5学海无涯限制性内切酶、连接试剂盒、DNA小量胶回收纯化试剂盒、质粒提取试剂盒均为大连宝生物工程有限公司产品；LipofectaminTM2000脂质体转染试剂盒购自Roche公司，DME

5、M培养基及胎牛血清购自Hyclon公司；蛋白Marker购自Tiangene公司；驴抗鼠的E6单克隆抗体购自SantaCruz公司；辣根过氧化物酶标记羊抗鼠的E6二抗及DAB显色系统购自北京中山公司.1.2方法BglⅡ和HindⅢ分别双酶切腺病毒穿梭质粒pAdTrackCMV和pET32a（+）E6E7，凝胶回收E6E7片段和线性化的pAdTrackCMV，连接（16℃,8h），转化DH5a感受态细菌，在卡那酶素抗性的LB平板上培养过夜，挑选转化的菌落，提取质粒，BglⅡ和HindⅢ双酶切鉴定阳性克隆，同时送上海生物工程公司测序

6、分析.提取pAdtrackCMVE6E7质粒，取1μg用PmeⅠ线性化，胶回收线性化的pAdtrackCMVE6E7质粒，转化到含有腺病毒基因组质粒AdEasy的BJ5183感受态细胞中［3］，在卡那酶素抗性的LB平板上培养16～24h，挑选较小的菌落培养，抽提质粒，琼脂糖凝胶电泳初筛重组体，再用PacⅠ酶切鉴定.PacⅠ线性化AdE6E7，乙醇、醋酸钠沉淀，700mL/L乙醇漂洗后重新溶解在20μL灭菌的去离子水中.配制A液（质粒DNA4μg+无血清DMEM至250μL）和B液（10μLLipofectaminTM2000以无

7、血清DMEM稀释至250μL），A，B混合，37℃反应2h.PBS漂洗细胞后每孔加入2mL无血清培养液，将混合物轻倾于培养孔中轻轻混合，继续培养8h后更新完全培养基，直至90%以上293细胞出现病变（cytopathiceffect,CPE）.收集上清继续感染293细胞以扩增病毒.用氯化铯密度梯度离心法纯化重组重组腺病毒AdE6E7.收集后的病毒层，0.22μm无菌过滤后小份分装，-80℃保存.Trizol试剂提取重组腺病毒感染293细胞和未感染293细胞的RNA取1μg细胞总RNA进行逆转录反应，总反应体积为50μL,37℃反

8、应1h,95℃5min，灭活逆转录酶.PCR扩增E6E7片段的上游引物PF摘要:5＇cgggatccatggaaaccggttagtataaa3＇，下游引物PR摘要:5＇cgggatcccatggtagattatggtt3＇.反应条件摘要：95℃变性5min,9