肥大心肌细胞分析论文.doc

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1、肥大心肌细胞分析论文【摘要】目的：观察压力超负荷性肥大心肌细胞表面AT1和AT2受体mRNA表达的动态变化.方法：构建压力超负荷性心肌肥大模型，于不同时间点急性分离心肌细胞.采用RTPCR法观察肥大心肌细胞中AT1和AT2mRNA表达的动态变化.结果：随着大鼠心肌肥厚程度的逐渐加重，于术后4wk起，AT1与AT2mRNA的表达水平较之假手术组均逐渐升高，8wk时继续升高.主动脉缩窄12wk组AT1的表达水平与8wk组无显著性差异，但AT2的表达水平从0.438±0.088进一步升高至0.580±0.0

2、66，且差异有显著性（P【关键词】心肌细胞受体血管紧张素II1型受体血管紧张素II2型0引言目前已发现细胞表面主要存在着血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）的两种受体，即Ⅰ型受体（AT1）及Ⅱ型受体（AT2）.已知AT1介导了几乎所有AngⅡ的生物学效应［1］，而AT2的功能至今尚不完全清楚.目前认为，AT2与胚胎发育、细胞分化、凋亡等生物过程有关，且在某些方面具有与AT1相拮抗的作用.AT2可以减轻或逆转心脏纤维化以及血管重塑［2］，从而对抗AT1介导的促纤维化作用；AT2可以引起血管舒张［3］，而这也与AT1引

3、起的血管收缩效应相反.成年期AT2的表达水平低下，在某些病理条件下,AT2及AT1的表达水平将会发生变化.由于这两型受体可能存在拮抗作用，因而在不同疾病条件下二者表达水平的变化将会对心脏的功能和结构起重要的调节作用.目前，有关心肌肥大过程中心肌细胞上AngⅡ受体动态变化的报道不多.我们以压力超负荷性肥大心肌细胞为实验对象，观察在细胞肥大过程中其表面AT1和AT2受体mRNA表达的动态变化及与心肌肥大之间的相互关系，以期进一步深入理解两型受体在心肌肥大发生中的作用及其机制.1材料和方法1.1材料雄性SD大

4、鼠36只，体质量220～250g（西安交通大学实验动物中心).AngⅡ，collagenaseⅠ5学海无涯，protease及BSA（Sigma公司）.Trizol及Taq酶（Promega公司），dNTPs及100bpDNALadder（华美生物工程公司）.引物由上海康成生物技术有限公司合成.其它试剂均为进口或国产分析纯.1.2方法1.2.1压力超负荷性心肌肥大模型的构建将实验动物随机分为2组各18只，腹主动脉缩窄组于左肾动脉上方小心分离长约3mm的腹主动脉，套以内径为0.8mm的银夹造成缩窄；假手术

5、组除不以银夹缩窄腹主动脉外，其余操作同腹主动脉缩窄组.术后分别饲养4wk（6只）、8wk（6只）及12wk（6只）.1.2.2心肌细胞的分离及心肌肥大指数测定采用胶原酶Langendorff法对心脏进行逆行灌流,待灌流结束首先测取左心室质量(包括左心室游离壁和室间隔)，计算左心室质量与体质量比值(LV/BW).而后获取含有左心室游离壁和室间隔的肥大心肌细胞.由于心肌细胞的体积和质量较成纤维细胞、微血管内皮细胞等大的多，因而经50g温和离心1min后，在置换上清液的同时梯度恢复溶液中Ca2+的浓度.此过程

6、重复3~4次后，基本去除所含非心肌细胞［4］.提取部分心肌细胞,使用目镜测微尺测量心肌细胞横径（TDM）.高倍镜下（10×40）随机选取20个视野,计算其中杆状心肌细胞横径，取其均值为该例左心室心肌细胞横径（LVTDM）.1.2.3RTPCR一步法提取细胞总RNA，逆转录成cDNA，PCR扩增.条件为：94℃变性1min,退火1min.72℃延伸1min，共30个循环，而后于72℃再延伸5min.引物序列、产物长度如下所示.βactin：正义链5′CCTGTACGCCAACACAGTGC3′，反义链

7、5′ATACTCCTGCTTGCTGATCC3′，211bp；AT1：正义链5′CAGCCGTCATCTACCGAAAC3′，反义链5′AGGAAAGGGAACACGAAGC3′,142bp；AT2：正义链5′ATCTGGCTGTGGCTGACTT3′,反义链5′AGCATATTTCTCAGGTGGG3′，362bp.以βactin作为内参照，用二者凝胶成像后的灰度值与βactin相比，代表其相对表达水平.统计学处理：数据以x±s表示，GraphPadPrism统计软件分析，不同时间点的LV/BW，

8、LVTDM，AT1和AT2mRNA的表达变化分析采用双因素方差分析，各组间相互比较采用t检验，P2结果2.1左心室质量/体质量及心肌细胞横径大鼠腹主动脉缩窄术后4，8，12wk时LV/BW，LVTDM与其同时点假手术组相比均显著增高(P5学海无涯2.2RTPCR与假手术组相比，随着大鼠心肌肥厚程度的加重，AT1与AT2mRNA的表达水平于术后4wk起逐渐升高，8wk时继续升高.12wk组AT1mRNA的表达水平(0.505±0.059)与