拮抗髓鞘抑制蛋白促进神经前体细胞分化机制

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1、拮抗髓鞘抑制蛋白促进神经前体细胞分化机制　　【摘要】目的建立局灶性缺血性脑梗死模型，观察Nogo-66受体（NgR1）拮抗剂（sNgR1-Fc）促进内源性成体神经前体细胞（NPCs）定向分化的作用，并探讨其机制。方法取SD大鼠12只，光化学法建立大脑皮层局灶缺血梗死（PCI）模型。设假手术组、PBS组和sNgR1-Fc治疗组。在PCI术后第1～3天，通过小型渗透性微泵持续性地向梗死灶同侧的侧脑室灌注sNgR1-Fc或同等体积的PBS；第4～6天，通过腹腔注射BrdU（bromodeoxyuridine）；在PCI术后35d，利用免疫组化染色观察各组海马齿状回NeuN+/BrdU+细胞的比率

2、；Westernblot检测梗死侧海马Notch1、Mash1及NeuroD蛋白的表达情况。结果光化学法可以成功地建立局灶性缺血性脑梗死模型。PCI术后35d时梗死灶同侧的海马齿状回，sNgR1-Fc处理组的BrdU+细胞的数目显著高于PBS组（P　　【Keywords】Nogo-66receptor；Corticalinfarction；Neuralprecursorcells；Differentiation；Proliferation；Axon；Regeneration；Signalpathway缺血性脑梗死发生后，体内的神经前体细胞（Neuralprecursorcells，10NP

3、Cs）被激活可分化为新的神经元，这种方法因避免了手术创伤、没有免疫排斥反应、减小了成瘤性风险，从而成为了一种理想的治疗策略。然而，这种内源性成体干细胞的自我激活存在明显的不足：激活的内源性神经干细胞数量少，许多激活的神经干细胞在数周内发生了凋亡及分化成神经元细胞的比例较低等[1]。因此，怎样促进脑缺血性损伤后神经干细胞的增殖及分化是一个尚未解决的问题。髓鞘抑制蛋白（包括Nogo-66、髓鞘结合糖蛋白、少突胶质细胞-髓鞘糖蛋白）可以通过与嵌在神经元细胞膜上的Nogo-66受体（NgR1，Theneuronalleucine-richrepeatprotein）的结合抑制神经纤维的再生长，正是

4、其在中枢神经系统损伤后的显著增加而发挥了抑制神经再生的作用[2]。笔者的前期研究已经证实在NPCs上存在着NgR1的表达，髓鞘抑制蛋白通过其发挥抑制NPCs分化的作用。由此可以假说，抑制在脑梗死发生后显著增加的髓鞘抑制蛋白的负性作用，可以促进NPCs分化为神经元而发挥治疗作用[3-5]。本研究拟建立局灶性缺血性脑梗死模型，观察NgR1拮抗剂sNgR1-Fc促进NPCs分化的作用，并初步探讨其机制。1材料与方法1.1实验动物所有动物实验遵照1996版《美国实验动物使用指引》（NIHPublicationsNo.1080-23）的要求进行，并获得中山大学动物伦理委员会的批准。所有实验遵循随机和

5、双盲的原则。1.2建立光化学法大脑皮层局灶缺血梗死模型（photothromboticcorticalinjury，PCI）选择体质量约250g的雄性SD大鼠，腹腔内注射氯胺酮（ketamine，80mg/kg）和甲苯噻嗪（xylazine，8mg/kg）进行麻醉。生理盐水稀释的玫瑰红（Rose-Bengal，40mg/kgbodyweight）通过股静脉注入体内。在脑立体定位仪上固定动物，把一根直径10mm的光导纤维棒定位连接在颅骨前囟点后3mm和中线向右旁开3mm的交界点。光导纤维棒的另一端连接冷白光源（VolpiIntralux6000，150W；VolpiAG，Schlieven，

6、Switzerland），用最大输出功率照射8min）[4]。在本研究中提到的假手术组大鼠，除不注射玫瑰红外，其余所有操作同上。模型组的动物按照随机接受的处理不同，分为PBS组和sNgR1-Fc组。各组大鼠总数各为4只，1只用于脑组织坏死的染色检查，3只用于Westernblot分析和细胞分化的组化染色。为鉴定制作局灶性脑梗死的有效性，对假手术组和脑梗死组的大鼠在PCI后24h对梗死的脑组织进行染色显示。动物麻醉后断头取脑，脑冠状切片，放入1%2，3，5-triphenyltetrazoliumchloride（TTC）（Genetime）生理盐水溶液中，37℃的恒温箱中孵育3010min

7、，缺血坏死的脑组织因线粒体被破坏而染色而成白色，取出脑片放至10%的福尔马林溶液中固定[4]。1.3溴脱氧尿苷标记及sNgR1-Fc干预治疗大鼠麻醉后，在脑立体定位仪上固定，切开头皮暴露颅骨表面。以前囟点后1.0mm，中线向右旁开1.5mm为中心，在颅骨上磨穿一直径0.2mm的小孔。连接好小型渗透性微泵（model1003D，flowrate0.1μL/h；Alzet，PaloAlto，California），将钢针垂直