mir—218抑制卵巢癌细胞a2780对顺铂耐药性实验探究

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1、miR—218抑制卵巢癌细胞A2780对顺铂耐药性实验探究　　[摘要]目的研究miR-218抑制卵巢癌细胞A2780对顺铂耐药性的影响及可能机制。方法实时定量PCR检测A2780及顺铂耐药细胞株A2780/DDP中miR-218的表达，转染miR-218inhibitors和mimics改变A2780及A2780/DDP细胞中miR-218的表达，MTT法检测转染前后细胞对顺铂的敏感性，并分析Wnt2B蛋白表达的改变。结果与A2780细胞相比，miR-218在A2780/DDP中的表达明显降低。A2780细胞转染miR-218inhibitors后

2、，细胞对顺铂的敏感性降低，Wnt2B蛋白表达明显增强；而A2780/DDP细胞转染miR-218mimics后，细胞对顺铂的敏感性增强，Wnt2B蛋白表达明显减少。结论miR-218可能通过靶向Wnt2B抑制卵巢癌细胞A2780对顺铂的耐药性。[关键词]miR-218；卵巢癌；顺铂耐药性；Wnt2B[中图分类号]R737.31[文献标识码]A[文章编号]1674-4721（2013）08（a）-0007-04卵巢癌死亡率位于女性生殖系统肿瘤之首，在女性肿瘤死亡率中位于第五位，多数死亡原因是肿瘤化疗耐药[1-2]。肿瘤耐药是个复杂的问题，涉及药物在体

3、内及细胞内的转运、代谢、细胞的损伤与修复等多个方面[3]。9microRNA是一种非编码的小核糖核酸，其在自然界广泛存在，包括人体。研究表明其参与肿瘤细胞的化疗耐药[4-5]。有报道显示，miR-218在卵巢癌、乳腺癌和恶性黑色素瘤中均下调[6]，而在急性淋巴细胞白血病中为高表达[7]，这表明miR-218表达有细胞种属性，在不同的肿瘤细胞中功能和作用可能不同。还有报道显示，miR-218参与宫颈癌对顺铂的化疗耐药[8-9]。在卵巢癌中，具体情况如何，目前未见报道。1材料与方法1.1材料卵巢癌细胞A2780及其衍生的顺铂耐药细胞株A2780/DDP

4、，均获赠于华中科技大学同济医院肿瘤生物研究中心。RPMI1640培养基、小牛血清、脂质体2000（美国LifeTechnologies公司）。顺铂、噻唑蓝（MTT）（美国Sigma公司）。miR-218mimics和inhibitors及阴性对照（美国Dharmacon公司）。Wnt2B抗体（美国Abcam公司）。β-actin（美国SantaCruz公司）。Trizol（美国Invitrogen公司）。miR-218逆转录引物及实时定量PCR扩增引物、反转录试剂盒、TaqManMicroRNA试剂盒、U6snRNA（中国锐博公司）。1.2A278

5、0及A2780/DDP细胞中miR-218表达的Real-timePCR检测9A2780及A2780/DDP细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中，于37℃、5%CO2、饱和湿度的恒温密闭培养箱内传代、培养，细胞处于生长对数期时进行实验。按照Trizol说明书抽提总RNA，应用反转录试剂盒，按产品说明书将总RNA反转录成cDNA，应用TaqManMicroRNA试剂盒对合成的cDNA进行实时定量PCR反应，反应条件：95℃变性1min；95℃15s，60℃20s，70℃15s，40个循环，U6作为内参照，分别进行数据分析。每一实验重复

6、3次。1.3miR-218mimics与inhibitors的转染将处于生长对数期的A2780及A2780/DDP细胞接种于6孔板中，每孔加入1×106个细胞，培养24h。按照脂质体2000说明书进行阴性对照（NC组）、miR-218inhibitor和mimics组的转染，并设置空白对照。将miR-218inhibitors及对照转染于A2780细胞中，miR-218mimics及对照转染于A2780/DDP细胞中。转染6h后换新培养基，继续培养24h用于后续实验。Real-timePCR检测转染效率。1.4MTT法检测转染前后的细胞对顺铂的敏感

7、性将转染前后的A2780及A2780/DDP细胞，以每孔5×103个细胞接种于96孔培养板中。24h后加入浓度分别为0、10、20、30、40、50μmol/L的顺铂，每个浓度设3个复孔，培养48h后加入MTT溶液（5mg/ml）15μl，继续培养4h，弃上清，加入100μlDMSO后振荡209min，在酶联免疫检测仪上选择波长570nm测定各孔光密度值（D），取重复孔光密度值的平均值。各浓度梯度孔的细胞存活率（%）=（D实验孔/D对照孔）×100%，绘制细胞的存活曲线。1.5细胞中Wnt2B蛋白表达的免疫印迹检测收获对数生长期转染前、转染mimi

8、cs和inhibitors后及对照组的细胞，以100μl预冷的细胞裂解液裂解30min，10000×g4℃下离心10min