木聚糖酶在大肠杆菌中的表达.doc

《木聚糖酶在大肠杆菌中的表达.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、嗜热内切木聚糖酶基因xyn10B克隆及其在大肠杆菌中的表达食品科学093谢江英2009016513自Horflcoshi于1973年首次报道了来自细菌中的木聚糖酶以来，国外科研工作者已分离出百余种不同微生物来源的木聚糖酶，并将其基因在各种宿主菌中得到活性表达。由于高产野生的微生物生产木聚糖酶时，释放出的产物较为复杂，往往产生大量的纤维素酶，导致在应用中产生不必要的麻烦。如在纸浆预漂白时，纤维素会被意外降解。并且这些酶的性质极为相近，分离纯化的成本较高，不利于木聚糖酶的推广使用，通过基因工程的方法来构建一些

2、高效表达或胞外分泌的工程菌株，将有助于解决木聚糖酶的大量收集和纯化问题。我国对木聚糖酶的研究最近十几年才开始，大多限于天然木聚糖酶高产菌株的筛选，木聚糖酶的分离、纯化及性质分析，仅克隆和表达了少数木聚糖酶基因，而运用基因工程手段产业化生产木聚糖酶制剂在国内还刚刚起步。本研究从CaldicellulosiruptorbesciiDSM6725分离出木聚糖酶基因xyn10B，连接于表达载体pET-28a（+）的NcoⅠ和XhoⅠ酶切位点之间，构建重组表达质粒pET28a-xyn10B，转化大肠杆菌E.coli

3、BL21（DE3）codonplus-RIL，构建基因工程菌，实现木聚糖酶高效表达。1实验材料1.1菌株和质粒（1）热解纤维素菌CaldicellulosiruptorbesciiDSM6725；（2）质粒pET-28a；（3）大肠杆菌E.coliBL21（DE3）codonplus-RIL；1.2实验材料及主要试剂1.2.1抗生素氨苄青霉素，卡那霉素1.2.2试剂胰化蛋白胨、酵母提取物、琼脂糖；PCR引物合成；DNA测序；不同来源底物；其他常用化学试剂。1.2.3工具酶限制性内切酶NcoI、XhoI、T

4、4DNA连接酶、TaqDNA聚合酶、DNAMarker（DL2000DNAMarker和λ-HindⅢdigestDNAMarker）。1.2.4试剂盒PCR产物回收试剂盒，质粒小提试剂盒，细菌基因组提取试剂盒，DNA凝胶回收试剂盒，Ni-柱纯化柱料。2.培养基及主要试剂配制（1）TAEbuffer：核酸电泳缓冲液Tris-乙酸0.04mol/LEDTA0.001mol/L（2）5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：Tris碱15.1g甘氨酸94gSDS5g去离子水补齐至1000ml。（3）考马斯亮蓝染色液配方

5、甲醇/水（1:1，v/v）90ml冰醋酸10ml考马斯亮蓝R2500.25g应用Whatman1号滤纸过滤，除去杂质，室温；备用。（4）考马斯亮蓝脱色液乙醇100mL乙酸50mL蒸馏水定容至1L。（5）8×bindingbuffer（连接缓冲液）NaCl4MTris-HCl（pH7.9）160mM（6）8×chargebufferNiSO4800mM（7）8×washbuffer（洗涤缓冲液）咪唑800mMNaCl4MTris-HCl（pH7.9）160mM（8）4×stripbufferEDTA400m

6、MNaCl2MTris-HCl（pH7.9）80mM（9）蛋白质SDS-PAGE凝胶的配制溶液成分分离胶12%（5mL）浓缩胶5%（2mL）H2O1.61.430%丙烯酰胺溶液2.00.331.5mol/LTris-HCl（pH8.8）1.3---1.0mol/LTris-HCl（pH6.8）---0.2510%SDS0.050.0210%过硫酸铵0.050.02TEMED0.0050.002（10）宽范围缓冲液乙酸100mMN-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸（HEPS）100mMN-三（羟甲基）甲基-3

7、-氨基丙磺酸（TAPS）100mM3-环已胺基丙磺酸（CAPS）100mM2-码啉乙磺酸（MES）100mM分别在60℃，70℃下精确配制100mM不同pH的缓冲液，使用1MNaOH调节至所需的pH值。3.实验仪器振荡培养箱、无菌操作台、0.22μm无菌滤器、冷冻高速离心机、2550紫外分光光度计、GenepulserXcell、实验室水纯化系统、超滤管Ultrafreet-MC10kDa、垂直电泳仪、无油真空抽滤仪、AKTAprimeplus蛋白层析仪、聚合酶链式反应器⑴.Caldicellulosir

8、uptorbesciiDSM6725的液体培养按照DSMZ的配方，配置厌氧培养基，分装于厌氧试管中，每管5ml，培养基封闭后用真空泵将试管中的空气抽干，并充入一定量的氮气和二氧化碳的混合气体（80%N2和20%CO2）。在厌氧箱中用培养基1m溶解购买于DSMZ的CaldicellulosiruptorbesciiDSM6725，按照1%的接菌量接种于5ml试管中，混匀，75℃静置培养数天，直至细菌开始生长起来。然后转移至装有1