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时间:2020-09-05
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1、实验十、过氧化物酶活性测定【实验目的】掌握测定过氧化物酶活性常用的比色法及其原理【实验原理】过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中,本实验以邻甲氧基苯酚(即愈创木酚)为过氧化物酶的底物,在此酶存在下,H2O2可将邻甲氧基苯酚氧化成红棕色的4-邻甲氧基苯酚,此产物在470nm处有最大光吸收,因此可通过测量OD470,以每分钟OD变化值表示酶活性大小。【实验试剂】20mmol/LKH2PO4反应混合液:100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)50ml于烧杯中,加入愈创木酚28μl,于磁力搅拌器上加热搅拌,直至愈创木酚溶解,待溶液冷却后,加入30%过氧化氢19
2、μl,混合均匀,保存于冰箱中。【实验步骤】l.粗酶液的制备:取马铃薯块茎洗净去皮,称取2g,切碎置入研钵中,加20mmol/LKH2PO410ml研成匀浆转入离心管中,4000r/min离心10min,取上清液转入试管保存于冷处,残渣再用10mLKH2PO4提取1次,合并上清液并记录总体积(提取酶液的总体积),低温下保存备用。2.酶活性测定:取4只试管编号,1号管加入反应混合液3ml+KH2PO41ml作为参比;2号管、3号管、4号管均加入反应混合液6ml+提取的酶液2ml,立即测定2、3、4号管OD470值,然后将2号管放入4℃冰箱,3号管放于室温,4号管
3、沸水浴,10min后再分别读数。3.结果计算:以每分钟内OD470变化0.0l为1个过氧化物酶活性单位(U),分别计算2、3、4号管过氧化物酶的活性。过氧化物酶活性=式中,△D470——反应时间内吸光度的变化;W——马铃薯鲜重(g);t——反应时间(min);VT——提取酶液总体积(mL);VS——测定时取用酶液体积(mL)。【注意事项】酶液要低温保存。【思考题】酶活性的影响因素有哪些?分析温度对酶活性的影响?
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