实验十 过氧化物酶活性测定.doc

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1、实验十、过氧化物酶活性测定【实验目的】掌握测定过氧化物酶活性常用的比色法及其原理【实验原理】过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中，本实验以邻甲氧基苯酚（即愈创木酚）为过氧化物酶的底物，在此酶存在下，H2O2可将邻甲氧基苯酚氧化成红棕色的4-邻甲氧基苯酚，此产物在470nm处有最大光吸收，因此可通过测量OD470，以每分钟OD变化值表示酶活性大小。【实验试剂】20mmol/LKH2PO4反应混合液：100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)50ml于烧杯中，加入愈创木酚28μl，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30%过氧化氢19

2、μl，混合均匀，保存于冰箱中。【实验步骤】l．粗酶液的制备：取马铃薯块茎洗净去皮，称取2g，切碎置入研钵中，加20mmol/LKH2PO410ml研成匀浆转入离心管中，4000r/min离心10min，取上清液转入试管保存于冷处，残渣再用10mLKH2PO4提取1次，合并上清液并记录总体积（提取酶液的总体积），低温下保存备用。2．酶活性测定：取4只试管编号，1号管加入反应混合液3ml+KH2PO41ml作为参比；2号管、3号管、4号管均加入反应混合液6ml+提取的酶液2ml，立即测定2、3、4号管OD470值，然后将2号管放入4℃冰箱，3号管放于室温，4号管

3、沸水浴，10min后再分别读数。3．结果计算：以每分钟内OD470变化0.0l为1个过氧化物酶活性单位(U)，分别计算2、3、4号管过氧化物酶的活性。过氧化物酶活性＝式中，△D470——反应时间内吸光度的变化；W——马铃薯鲜重（g）；t——反应时间（min）；VT——提取酶液总体积（mL）；VS——测定时取用酶液体积（mL）。【注意事项】酶液要低温保存。【思考题】酶活性的影响因素有哪些？分析温度对酶活性的影响？