第15章 电泳分离技术ppt课件.ppt

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1、第八章电泳分离技术1本章主要内容一、概述二、电泳技术原理三、电泳技术问题和对策四、在生物技术研究上应用的电泳技术五、生物技术产品分离纯化上应用的电泳技术2一、概述电泳技术是指带电荷的供试品(蛋白质、核苷酸等)在惰性支持介质(如纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等)中,于电场的作用下,向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动,使组分分离成狭窄的区带,用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其含量(%)的方法。应用最普遍的是以滤纸或凝胶作为载体,故称为纸电泳法或凝胶电泳法。3电泳技术发展简史1809年俄国物理学家Рейсе首次发现电泳现象。他在湿粘土中

2、插上带玻璃管的正负两个电极,加电压后发现正极玻璃管中原有的水层变混浊,即带负电荷的粘土颗粒向正极移动,这就是电泳现象。1909年Michaelis首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳。他用不同pH的溶液在U形管中测定了转化酶和过氧化氢酶的电泳移动和等电点。41937年瑞典Uppsala大学的Tiselius对电泳仪器作了改进,创造了Tiselius电泳仪,建立了研究蛋白质的移动界面电泳方法,并首次证明了血清是由白蛋白及α、β、γ球蛋白组成的,由于Tiselius在电泳技术方面作出的开拓性贡献而获得了1948年的诺贝尔化学奖。5从本世纪50年代起,特别是1

3、950年Durrum用纸电泳进行了各种蛋白质的分离以后,开创了利用各种固体物质(如各种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等)作为支持介质的区带电泳方法。61959年Raymond和Weintraub利用人工合成的凝胶作为支持介质,创建了聚丙烯酰胺凝胶电泳,极大地提高了电泳技术的分辨率,开创了近代电泳的新时代。30多年来,聚丙烯酰胺凝胶电泳仍是生物化学和分子生物学中对蛋白质、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍,分辨率最高的分析鉴定技术,是检验生化物质的最高纯度:即"电泳纯"(一维电泳一条带或二维电泳一个点)的标准分析鉴定方法,至今仍被人们称为是对生物大

4、分子进行分析鉴定的最后、最准确的手段,即"LastCheck"7由80年代发展起来的新的毛细管电泳技术,是化学和生化分析鉴定技术的重要新发展,己受到人们的充分重视。8电泳技术的重要性电泳技术是一种先进的检测手段,与其它先进技术相配合,能创造出惊人的成果,可使人们用较少代价获得最优效益。比如它对解决当前人类所面临的食品、能源、环境和疾病等一系列迫切问题,都有积极作用,显示出强大的生命力。因此电泳技术正越来越多地为人们所重视,广泛应用于各个领域。9在医院临床检验中,利用电泳技术分析血清中的酶及同工酶,可以诊断肾病综合症、心绞痛、肝硬化、肝癌、多发生骨髓瘤、恶

5、性肿瘤、乙型肝炎、慢性肝炎等疾病;分析血色素组份,可以判定血细胞的正常与异常10一九八四年九月,美国在航天飞机上首先使用电泳技术提炼了一种治疗糖尿病的新药----胰岛素β细胞,为全世界上百万糖尿病患者带来了福音。电泳技术在太空的应用,更使它一时身价百倍,由于太空无重力作用,电泳液中不存在冷热对流现象,从而不影响分离效果。被分离的物质纯度高,成本低,如治疗血栓病的尿激酶,在太空生产,产量可以提高四百倍,售价可降低百分之九十,美国每年患血栓病的人有一百多万,只此一项即可节约几亿美元。11电泳分离:是利用带电粒子在电场中泳动速度的差别进行分离的方法。实验室中强

6、有力的分析、鉴定和分离技术——更大规模的制备应用。与HPLC相比在可靠性、分辨率、使用的难易度和成本上具优势。在生物技术研究和产物分离纯化应用的是区带电泳。12电泳分类按分离的原理区分:区带电泳移界电泳等速电泳等电聚焦13区带电泳:是在半固相或胶状介质上加上一个点或一薄层样品溶液,然后加电场,分子在支持介质上或支持介质中迁移。是应用最广泛的电泳技术之一。141516按电场分:常压(<500V,适用大分子)、高压(>500V,适用小分子)仪器装置分:水平式、垂直式、悬架式17二、电泳技术原理生物技术研究对象:主要是核酸和蛋白质蛋白分子带电荷的基团:正电荷(

7、氨基、亚氨基、酰氨基)、负电荷(羧基、苯酚基、巯基);基团所带电荷的性质和数量随溶液环境(如pH和离子强度)变化。蛋白分子在电场内迁移所受到的力(F)与电场强度(E)及蛋白分子的净电荷成正比关系。18另一种表示方法:μ由上式可知:蛋白质在电场内迁移速度与它的净电荷成正比,与它的分子的半径及溶液的黏度成反比。19注意:电泳使用的缓冲液的pH值、缓冲剂的类型、浓度及样品中的盐浓度均需要仔细选择。原因?低离子溶液中,带不同电荷的蛋白分子之间会发生相静电作用,形成大的分子团,从而影响到迁移速度;加大离子强度,可减少此种情况,但会提高电流,从而产生更多的热量,温度

8、升高会促进蛋白质分子扩散,使电泳区带变宽,降低分辨率。20应用最广泛的聚丙烯酰胺

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