《电泳分离》PPT课件

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1、第七节电泳分离电泳（electrophoresis,EP）：指带电粒子在电场中向着与其所带电荷性质相反的电极方向移动的过程。电泳技术是根据各种带电粒子在电场中迁移速度的不同而对物质进行分离的实验技术。1一、电泳的基本理论1.原理:在一定pH条件下（用buffer），不同大小、形状的带电颗粒在电场中的移动速度不同（用迁移率表示），各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。+2迁移率与内在特性和外界条件有关内在特性：颗粒性质（净电荷量，颗粒大小、形状）外界条件：电场强度、溶液性质、支持体特性带电粒子

2、在单位时间内移动的距离称为电泳迁移率。移动速度(V)是电场(E)和迁移率(m)的乘积，即：V＝mE3影响迁移率的因素：1）颗粒性质：Q越大、r越小、形状越接近球形，v越快。2）电场强度：每厘米距离的电压差，E越高，v越快。常压电泳E：2－10V/cm电压：100－500V，大分子物质分离高压电泳E：20－200V/cm电压>500V，小分子物质分离3）溶液性质：pH值：影响粒子所带净电荷量的多少，离pI越远，v越快。（用buffer保持恒定）离子强度：离子强度越高，v越低。通常，缓冲液离子强度在

3、0.02-0.2之间。4）电渗：在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。应避免用高电渗物质作支持介质。4自由界面电泳：又称移动界面电泳（movingboundaryelectrophoresis,MBEP），指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。区带电泳:（zoneelectrophoresis,ZEP）指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。支持介质的作用:防止电泳过程中的对流和扩散。2.电泳的分类5按支持介质种类的不同，区带电泳可分为：①纸电泳：用滤纸作为支持介质，多用于核苷

4、酸的定性定量分析。②醋酸纤维素薄膜电泳：医学上，常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白，优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电泳分辨率高。以上两种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子筛效应，主要靠被分离物的电荷多少进行分离。6③琼脂糖凝胶电泳：从琼脂中精制分离出的胶状多糖，一般用于核酸的分离分析。（1）琼脂糖凝胶孔径较小，具有分子筛效应；（2）机械强度高：可以在浓度1%以下使用；（3）无毒；（4）染色、脱色程序简单，背景色较低；（5）热可逆性；（6）生物中性：一般不与生物材料结合。④聚丙烯酰胺凝胶电泳

5、：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。分辨率较高。聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的两种支持介质。73.电泳常用设备（1）电泳仪：为电泳提供稳定直流电源的装置。常压电泳仪（600V）高压电泳仪（3000V）超高压电泳仪（30000V～50000V）（2）电泳槽：自由界面电泳槽管状电泳槽板状电泳槽（3）附属设备：外循环恒温系统:高电压会产生高热，需冷却。灌胶模具：制胶，玻璃板和梳子。891011二、聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophor

6、esis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。121.原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（acrylamide，简称Acr）和交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺（methylanebisacrylamide，简称Bis）在催化剂和加速剂作用下聚合的。13CH2=CHC=ONH2CH2=CHC=ONHCH2NHC=OCH2=CH-CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CH-C=OC=OC=ONH2NH2NHCH2NHC=O-CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CH-C=O

7、C=ONHNH2丙烯酰胺N,N’-甲叉双丙烯酰胺聚丙烯酰胺1415（1）催化剂和加速剂的浓度：浓度小易导致聚合速度慢；浓度过大则易导致电泳时的烧胶以及电泳带的畸变；一般控制使聚合过程在40－60分钟内完成。（2）系统pH值：酸性条件、碱性条件均可，但仍然存在一个最佳pH值，以获得最佳的聚合结果。（3）温度：低温下聚合导致凝胶变脆和混浊，适当提高温度可以使凝胶透明而有弹性。（4）分子氧：分子氧的存在会阻碍凝胶的化学聚合；抽气。（5）系统纯度：金属离子会影响凝胶的聚合。影响丙烯酰胺聚合的主要因素16

8、聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：1）化学催化系统：AP-TEMED催化剂：过硫酸铵（ammoniumpersulfate，AP）加速剂：TEMED（N，N，N’，N’-四甲基乙二胺）2）光催化系统：核黄素－光催化剂:核黄素（维生素B2）引发剂:光TEMED的存在，可加速聚合。.17聚丙烯酰胺凝胶：丙烯酰胺＋N,N’－甲叉双丙烯酰胺聚合而成18凝胶的机械强度、弹性和透明度、粘着度取决于凝胶总浓度（T）和交联度（C）。T=C=凝胶浓度越大（小），孔径越小（大），可分离分子量较小（大）的颗粒。Ac