第八章 电泳分离技术ppt课件.ppt

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1、第八章电泳分离技术1主要内容第一节概述第二节聚丙烯酰胺凝胶电泳第三节SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳第四节等电聚焦电泳第五节双向凝胶电泳第六节毛细管电泳1.1电泳的基本概念电泳：带电物质在电场中向相反电极移动的现象。电泳迁移率：在单位电位梯度的作用下，单位时间内质点所移动的距离。电泳分离技术：利用带电物质在电场中泳动速度的差别而进行分离的方法。31.2电泳的理论基础41.2.1影响电泳速度的因素①电场强度：泳动速度与电场强度成正比；②溶液的pH值：pH距待分离物质的pI越远，泳动速度越大；③溶液离子强度：离子强度越小,电动势越大,泳动速度越快；④溶液的黏度：泳动速度与溶液的黏度成反比；⑤电渗

2、现象：在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。⑥颗粒的性质：一般所带电荷量越大、直径越小或其形状越接近于球形，迁移率就越大。51.2.2两种离子型物质A和B的混合物的分离和61.3电泳技术分类淀粉凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳纸电泳醋酸纤维薄膜电泳薄层电泳凝胶支持物区带电泳非凝胶支持物电泳显微电泳等电聚焦电泳等速电泳不用支持物电泳用支持物区带电泳是否用支持物7薄层电泳板电泳柱电泳。根据支持介质形状不同电泳系统的连续性连续电泳不连续电泳分析电泳制备电泳定量、免疫电泳。用途不同电泳的方向不同水平电泳垂直电泳8第二节聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamid

3、egelelectrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好，有弹性，透明，化学性质稳定，对pH和温度变化小，没有吸附和电渗作用小的特点，是一种很好的电泳支持介质。PAGE按凝胶的形状可分为：圆盘状电泳垂直或平板状电泳9CH2=CHC=ONH2CH2=CHC=ONHCH2NHC=OCH2=CH丙烯酰胺(Acr)N,N’-甲叉双丙烯酰胺(Bis)-CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CH-C=OC=ONH2NHCH2NHC=O-CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CH-C=OC=ONHNH2聚丙烯酰胺102.1

4、基本原理2.1.1聚丙烯酰胺凝胶的聚合1)化学聚合化学聚合的催化剂通常采用过硫酸铵，此外还需要加速剂TEMED（N，N，N’，N’-四甲基乙二胺），它能以自由基的形式存在。微量TEMED的加入，可使过硫酸铵形成自由基：S2O82-2SO4-这些自由基的产生可引发丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的聚合、交联反应，形成有一定平均孔径的聚丙烯酰胺。.112)光聚合光聚合通常用核黄素为催化剂，核黄素经光照形成无色基，再被痕量氧氧化形成自由基，引发聚合反应。TEMED的存在，可以加速聚合。上述聚合反应受许多因素的影响：（1）大气氧能淬灭自由基，阻止多聚体链长的增加。在进行化学聚合前，一般用减压抽气的办

5、法除去溶液中溶解的空气。在胶液表面，往往覆盖一层水或溶液，隔绝空气，可加速聚合。（2）低温、低pH都会减慢聚合反应速度。（3）有些材料如聚丙烯酸甲酯有机玻璃，一些金属等可抑制聚合反应。122.1.2凝胶用量计算聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小取决于凝胶总浓度（T%）和交联度（C%）。T%=C%=式中a代表单体Arc的重量(g)，b代表交联剂Bis的重量(g)，m代表溶液的体积(mL)a+bm×100%aa+b×100%13分子量范围适宜凝胶浓度T%<10420~301-4×10415~204104-1×10510~15105-5×1055~10>5×1052~5表分离蛋白质选择聚丙烯酰胺凝胶

6、浓度参考值在浓度为7.5%的凝胶中，大多数生物体内的蛋白质能得到满意的分离效果。因此，把浓度为7.5%凝胶称为标准胶。对于一个未知样品，常用7.5%的标准胶或4%-10%的凝胶梯度来测试，而后选出适宜的凝胶浓度。142.1.3分离效应聚丙烯酰胺凝胶电泳分为:连续性电泳不连续性电泳:凝胶层的不连续性缓冲液离子成分的不连续性pH值的不连续性电位梯度的不连续性电泳时产生的3种物理效应:浓缩效应电荷效应分子筛效应15A.样品的浓缩效应缓冲液成分及pH的不连续性浓缩胶pH6.7缓冲液浓缩胶Tris-HCl,电极缓冲液Tris-Gly缓冲液样品浓缩胶分离胶16缓冲液成分及pH的不连续性导致蛋白质

7、样品浓缩效应示意图快离子慢离子蛋白质样品解离度：Cl>蛋>Glymclcl>m蛋蛋>mGlyGly凝胶中Cl－为快离子，Gly－为慢离子，蛋白质样品被夹在中间。17凝胶层的不连续性样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3)蛋白质从“－”极向“＋”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。缓冲液样品浓缩胶分离胶18E：每厘米的电压降E＝I(电流强度)/(电导率)E与电泳速度成正比电泳开始后，由于快离子泳动率最大，在快离子后面形成