电泳分离概述课件.ppt

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1、电泳分离1主要内容1概述2电泳的分类3聚丙烯酰胺凝胶电泳4SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳5等电聚焦电泳21809年俄国物理学家Peiice首次发现电泳现象，他在湿粘土中插上带玻璃管的正负两个电极，加电压后发现正极玻璃管中原有的水层变浑浊，即带负电荷的粘土颗粒向正极移动，这就是电泳现象。1909年Michaelis首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳。他用不同pH的溶液在U形管中测定了转化酶和过氧化氢酶的电泳移动和等电点。1937年，Tiselius(瑞典)将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，第一次将人血清提取的蛋白质混合

2、液分离出白蛋白和α、β、γ球蛋白。一、概述1、电泳的发展史31948年Wieland和Fischer重新发展了以滤纸作为支持介质的电泳方法，对氨基酸的分离进行过研究。从本世纪50年代起，特别是1950年Durrum用纸电泳进行了各种蛋白质的分离以后，开创了利用各种固体物质(如各种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等)作为支持介质的区带电泳方法。4电泳：带电荷的物质（如蛋白质、核酸等）处于惰性支持介质（固态或液态）中，在电场的作用下，向其相反的电极方向泳动的现象。电泳分离：带电物质在电场的作用下，因其所带电荷性质、电荷数量以及分子量大小的不同

3、而产生的泳动方向、泳动速度的不同，最终使得混合组分得以分离的操作单元。2、电泳的概念5电泳分离的基础建立在蛋白质是带电颗粒这一事实上的。蛋白质的电荷来源于氨基酸的离子化侧链基团，包括酸性残基，、碱性残基、络氨酸残基以及荷电的非蛋白质组分如脂类或者碳水化合物。大多数这些酸和碱都很弱，使得蛋白质的整体电荷具有很大的pH依赖性。而在一特定的pH下，不同蛋白质分子由于氨基酸组成不同，所带电荷的电性和电量也不同，由此可进行蛋白质的分离和分析。3、电泳分离的基本原理6带电粒子在单位电场强度下的泳动速度称为电泳迁移率。m=v/E=(d/t)/(V/L)式中，m

4、为迁移率；v为迁移速度；E为电场强度；d为迁移距离；t为电泳时间；V为电压；L为凝胶长度；由于球形分子在电场中收到的动力和阻力，即EQ=6πrηvQ为别分离物质所带静电荷；η为介质黏度；r为分子半径；于是有m=Q/6πrη即迁移率和球形分子的半径、介质黏度、颗粒多带电荷有关。78内在特性：颗粒性质（静电荷量、颗粒大小、形状）外在特性：电场强度、溶液的离子强度、pH值、电渗作用、电泳介质的性能。1）颗粒性质Q越大、r越小、形状越接近球形，v越快。4、影响迁移率的因素92）电场强度单位长度的电位降称为电场强度，也叫电势梯度（V/m）。如电泳槽长20c

5、m，电压200V，则电场强度200÷20=10V/cm。电场强度越大，电泳速度越快，但是会产生大量热量，需要配备冷却设备。常压电泳E：2－10V/cm电压：100－500V，大分子物质分离。高压电泳E：20－200V/cm电压>500V，小分子物质分离。103）溶液离子强度离子浓度过高引起带点质点吸引相反粒子聚集其周围，形成一个与带点质点电荷相反的离子氛，通过降低带电粒子量和增加阻力使运动质点迁移速率降低；则电流过大、产热过多，使区带变宽、蛋白质变性。11溶液离子强度过低降低缓冲液的总浓度和缓冲剂量，不宜维持溶液的pH值，进而影响溶质的带电量；其

6、次蛋白质之间有时候会发生相互静电作用，形成更大的分子团，影响迁移速率；而且电泳过程中由于电子流动产生热量，所以解决设备温度控制问题成为电泳和电色谱设备放大的难题。124）溶液pH值溶液的pH值决定带电物质的解离程度，也决定物质所带净电荷的多少.对蛋白质，氨基酸等类似两性电解质，pH值离等电点越远，粒子所带电荷越多，泳动速度越快，反之越慢。因此，当分离某一种混合物时，应选择一种能扩大各种蛋白质所带电荷量差别的pH值，以利于各种蛋白质的有效分离.为了保证电泳过程中溶液的pH值恒定，必须采用缓冲溶液135）电渗作用电场作用下，溶液对固体支撑物的相对运动

7、称为电渗。固体支撑物多孔且带有可解离的带电基团，解离后常吸附溶液中带正电或负电的反离子，这些反离子不是固定的，随着电压梯度运转到正极或负极，直至被下一带电基团所捕获。总体效果就是溶液在电场作用下向正极或负极移动。电渗影响带电质点的迁移速度。但在保持一定的电渗流是有益的，比如免疫电流。146）电泳介质的性能样品的扩散或对流会干扰样品的分离，为此可以使用支持介质以防止电泳过程中的对流和扩散。支持介质必须是化学惰性的，且均匀，化学稳定性好，且具有合适的渗流。155、检测方法电泳结束后，被分离的蛋白质区带仍然保持在胶内，这时可以通过染色而显示出分离图谱，

8、从而检测样品的分离情况。常用的全蛋白质染色方法有：考马斯亮蓝法、银染色法，荧光染色法。考马斯亮蓝法通过范德瓦尔斯键结合到蛋白质的碱性集团