《电泳分离技术》PPT课件

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1、第十一章电泳分离技术广泛应用于各个科学领域的新型分离技术概述在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为电泳。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同，可实现分离。1809年俄国物理学家Peiice首次发现电泳现象，他在湿粘土中插上带玻璃管的正负两个电极，加电压后发现正极玻璃管中原有的水层变浑浊，即带负电荷的粘土颗粒向正极移动，这就是电泳现象。1909年Michaelis首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳。他用不同pH的溶液在U形管中测定了转化酶和过氧化氢酶的电泳移

2、动和等电点。1937年，Tiselius(瑞典)将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，第一次将人血清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和α、β、γ球蛋白。第一次的自由溶液电泳；第一台电泳仪；1948年，获诺贝尔化学奖；由于早期的电泳仪价格昂贵，分辨率低，易产生对流，因而逐渐发展起了区带电泳。自由界面电泳：又称移动界面电泳，是指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。其装置复杂，价格昂贵，费时费力，不便于推广应用。区带电泳是指在电泳迁移中以一个缓冲溶液饱和了的固相介质作为支持介质，减少外界干扰的电泳技术。凝胶电泳和等电聚焦

3、电泳由于其明显的优越性，得到了越来越广泛的应用。电泳分析的特点各种电泳技术具有如下特点：凡是带电物质均可应用某一电泳技术进行分离，并可以进行定性或定量分析；样品量极少；设备简单，可在常温下进行；操作简单省时；分辨率高。已被广泛应用于基础理论研究，临床诊断及工业制造等方面。电泳技术围绕制胶、电泳、染色三个技术环节，不断改进，以实现下列目标：1、提高分辨率及灵敏度。2、简化操作，缩短电泳时间。3、扩大应用范围。电泳的分类1.电泳按其分离原理不同，分为区带电泳、移动界面电泳、等速电泳、等电聚焦电泳等。①区带电泳②自由界面电泳③等速电泳：需使用专

4、用电泳仪，当电泳达到平衡后，各电泳区带相随，分成清晰的界面，并以等速向前运动。④等电聚焦电泳：由两性电解质在电场中自动形成pH梯度，当被分离的生物大分子移动到各自等电点的pH出聚集成很窄的区带。2.电泳按支持介质的不同，分为纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、琼脂凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、SDS——聚丙烯酰胺凝胶电泳等。3.电泳按支持介质形状的不同，分为薄层电泳、板电泳、柱电泳等。4.按用途不同可分为分析电泳、制备电泳、定量免疫电泳、连续制备电泳等。5.按所用电压不同可分为：①低压电泳：100v~500v，电泳时间较长，适于分离蛋白质等生物大分

5、子。②高压电泳：1000v~5000v，电泳时间短，有时只需几分钟，多用于氨基酸、多肽、核苷酸和糖类等小分子物质的分离影响电泳速度的因素颗粒性质：直径、形状、静电荷。电场强度：电场强度越高，带电颗粒的泳动速度越快常压：2-10V/cm溶液性质：电极溶液和蛋白质样品溶液pH、离子强度、溶液黏度。电渗：液体对固体支持物的相对移动。颗粒运动的方向与电渗方向一致时，加快颗粒的迁移率。反之亦然。支持介质的筛孔V:泳动速度cm/秒or分d:泳动距离cmt:电泳时间(秒/分)E:电场强度伏特/cmu:泳动率or泳动度(cm/伏·秒or分)U:电压常压(

6、100—500v)高压(500—10000v)仅需几分钟l:支持场的长度(有效长度)迁移率(mobility)：带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度.凝胶电泳主要介质为琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶琼脂糖——筛分作用小，适于大分子物质聚丙烯酰胺——分离效果好，分辨率高，适于小分子物质聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)是一种利用人工合成的凝胶作为支持介质的区带电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N，N－甲叉双丙烯酰胺经过聚合交联从而形成的三维空间凝胶网络。PAGE具有电泳和分子筛的双重作用。PAGE是目前最常用的电泳方法。原理以孔径大小

7、不同的聚丙烯酰胺凝胶为支持物，采用电泳基质的不连续体系（即凝胶层、缓冲液离子成分、PH、电位梯度均不连续），使样品在不连续的两层凝胶之间积聚浓缩成很窄的样品区带（厚度为0.1毫米），然后再进行分离，从而提高了分辨率。聚丙烯酰胺凝胶电泳的特点设备简单样品量小（1-100微克）时间短（30-60分钟）操作方便分离范围广（多肽，蛋白，多糖等）可提高灵敏度改为超微量测定（10-12~10-9）可用于蛋白质分子量测定凝胶特性机械性能、弹性、孔径大小等。T——单体的总百分浓度C——交联百分浓度a——丙烯酰胺的克数b——亚甲基双丙烯酰胺克数m——体积聚

8、丙烯酰胺凝胶的有效孔径取决于总浓度，随浓度的增加而降低。有效孔径决定蛋白质的分离聚合方式光聚合：核黄素为催化剂(阳光,日光)，制大孔胶。化学聚合：制小孔胶。过硫酸铵APS(引发剂)N,N,N’