《电泳分离》课件

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1、ElectrophoresisTheory,MethodsandAplications五、电泳技术电泳的概念电泳是指带电颗粒在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象。分辨率高，可以对混合物进行电泳分析，甚至结晶纯化的样品也可在电泳分析中分出两条带或更多的电泳带。方法温和，对不稳定的生物大分子的分离纯化有时比其它分离技术如沉淀法、离心、层析等更为方便、可靠，甚至可作为具有一定规模的制备方法。电泳的特点一、基本原理当带电粒子以速度ν在电场中移动时，受到大小相等、方向相反的电场推动力和平动摩擦阻力的作用。（一）基本原理电

2、泳阻滞力电场强度物质离子在电场中差速迁移是电泳分离的基础。（二）影响电泳速度的相关因素颗粒性质：带电颗粒在电场中泳动的速度与带电颗粒的净电荷量成正比，与颗粒的半径成反比。电场强度：E愈高，带电颗粒的泳动速度愈快。溶液性质：pH偏离分子的等电点愈远，解离度愈大，净电荷愈多，泳动速度越快；离子强度在0.02－0.2为宜;泳动速度与溶液黏度成反比。-SO4-SO4-SO4-SO4COO-Na+Na+吸附的反离子固定基团＋—4.电渗是支持物本身所带的电荷吸附溶液中性质相反的离子，在电场中移动的结果。其带电愈高，电渗力愈大。当颗粒

3、的泳动方向与电渗方向一致时，加快颗粒的泳动速度；当颗粒的泳动方向与电渗方向相反时，则降低颗粒的泳动速度。5.焦耳热电泳过程中释放的热量与电流强度的平方成正比。当电场强度或电极缓冲液离子强度增高，电流强度也增加，不仅降低分辨率，严重时甚至烧断或熔化支持介质。6.筛孔在筛孔大的凝胶中溶质颗粒的泳动速度快。二、聚丙烯酰胺凝胶电泳Polyacrylamidegelelectrophoresis（PAGE）以聚丙烯酰胺凝胶作为支持物的电泳方法。由于其分辨率高，不仅能分离含有各种大分子的混合物，而且可以研究生物大分子的特性，如电荷、

4、分子量、等电点及分子构型。聚丙烯酰胺凝胶电泳的优点：①孔径大小可调节，可用于分离多种生物分子。②机械强度好、弹性大，电渗低、分辨率高。③电泳分离后仍然保持生物活性，可用于生物大分子的制备。1.聚丙烯酰胺凝胶的合成丙烯酰胺N,N-甲基双丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶催化剂聚合反应凝胶丙烯酰胺和双丙烯酰胺量的确定烯溶液浓溶液交联剂结点TEM(投射电镜)imageofapolyacrylamide(聚丙烯酰胺)2.聚丙烯酰胺的聚合及影响因素（1）化学聚合：以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂，使丙烯酰胺、甲

5、基双丙烯酰胺发生连锁反应，形成网状的聚合物。pH：在碱性pH时，反应速率高；而在酸性条件时，同样浓度溶液，聚合速率减慢。温度：在低温时聚合，凝胶会变得脆而浑浊，且重复性差，在25℃聚合的凝胶则较透明和有弹性。O2：O2使过硫酸铵（AP）分解。（2）光聚合：以核黄素为催化剂在少量的氧存在下,分解成无色的还原型，在少量的O2条件下，还原型的核黄素氧化成有游离基的黄素环，聚合反应发生。核黄素B1还原型游离基聚合反应光照O2优点：用量少。聚合的时间可以自由控制。缺点：光照的量不容易掌握，重现性不太好。光聚合适合于大孔径凝胶的聚合

6、，化学聚合适合于各种凝胶的聚合。+＋＋蛋白质分子在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分离因素蛋白质的电荷量起主要作用蛋白质的分子大小起主要作用蛋白质分子的构型起主要作用三.不连续凝胶电泳的分离原理系统的不连续性表现在以下几个方面：凝胶系统的不连续性：上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。缓冲液离子组成及pH的不连续性：电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.8的Tris-HCl缓冲液，而分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。（一）原理在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即样品的浓缩效应，凝

7、胶的分子筛效应和电荷效应，由于这三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高。电位梯度的不连续性mCl-·aCl-＞m蛋-·a蛋-＞mGly-·aGly-1.浓缩效应Cl-：快离子；Gly-：慢离子电泳进行时，在快离子后面形成一离子浓度低的区域，该区域为低电导区。电导强度与电导成反比，因此，在低电导区产生较高的电场强度。在快离子和慢离子之间形成一个迅速移动的界面。样品蛋白质聚集在这个移动界面的附近，浓缩为一个狭窄的中间层（浓缩300多倍）。2.分子筛效应移动界面到达浓缩胶和分离胶界面时，凝胶的pH变化明显，缓冲液中甘氨酸的解

8、离迅速增加，迁移率超过蛋白质分子，随之高电场强度消失。当蛋白质分子量和构型不同时，通过分离胶所受到的阻滞程度不同，导致泳动率不同，结果依据分子量的大小而分开。3.电荷效应蛋白质所带电荷不同，泳动率也不同，故在同一电场强度中，单位时间内各分子迁移的距离存在差异。因此，蛋白质样品经分离胶电泳后，若样品组分的分子量相同，则