电泳分离技术ppt课件.ppt

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1、第十四章电泳分离技术本章内容SDS－PAGEHPCE(highperformancecapillaryelectrophoresis)IEF(isoelectricfocusing)2DGE(two-dimensionalgelelectrophoresis)第一节概述（generalization）在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为电泳。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同，可实现分离。1937年，Tiselius(瑞典)将蛋

2、白质混合液放在两段缓冲溶液之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，第一次将人血清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和α、β、γ球蛋白；第一次的自由溶液电泳；第一台电泳仪；1948年，获诺贝尔化学奖；聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)是一种利用人工合成的凝胶作为支持介质的区带电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N，N－甲叉双丙烯酰胺经过聚合交联从而形成的三维空间凝胶网络。第二节电泳技术原理1967年，Shapiro等人首先发现，如果在聚丙烯酰胺凝胶电泳系统中加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），则蛋白质分子的电泳迁移率

3、主要取决于蛋白质的分子量大小，当蛋白质的分子量在15，000－200，000之间时，样品的迁移率与其分子量的对数呈线性关系。SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)按照缓冲液的pH值和凝胶孔径的差异分为连续系统和不连续系统，由于SDS－不连续系统具有较强的浓缩效应，因此具有更高的的分辨力也就更多地为人们所采用。－＋Marker分子量大小SDS—PAGE当蛋白质分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为

4、常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。绘制标准曲线：按下式计算相对迁移率：以每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分于量，这样的标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性。注意事项1.不是所有的蛋白质都能用SDS-凝胶电泳法测定其分子量，已发现有些蛋白质用这种方法测出的分子量是不可靠的。包括：电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白

5、质（如某些糖蛋白）以及一些结构蛋白如胶原蛋白等。例如组蛋白F1，它本身带有大量正电荷，因此，尽管结合了正常比例的SDS，仍不能完全掩盖其原有正电荷的影响，它的分子量是21,000，但SDS-凝胶电泳测定的结果却是35,000。因此，最好至少用两种方法来测定未知样品的分子量，互相验证。2．有许多蛋白质，是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如α-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在SDS和巯基乙醇的作用下，解离成亚基或单条肽链。因此，对于这一类蛋白质，SDS-凝胶电泳测定的只是它们的亚基或单条肽链的分子量，而不是完整分子的

6、分子量。为了得到更全面的资料，还必须用其它方法测定其分子量及分子中肽链的数目等，与SDS-凝胶电泳的结果互相参照。作业题1．SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳与聚丙烯酰胺凝胶电泳原理上有何不同？2.用SDS-凝胶电泳法测定蛋白质分子量时为什么要用巯基乙醇？3．用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量，为什么有时和凝胶层析法所得结果有所不同？是否所有的蛋白质都能用SDS-凝胶电泳法测定其分子量？为什么？高效毛细管电泳HPCE(highperformancecapillaryelectrophoresis)高效毛细管电

7、泳仪器（1）高效毛细管电泳仪器（2）高效毛细管电泳仪器（3）传统电泳分析缺点：操作烦琐，分离效率低，定量困难，无法与其他分析相比。1981年，Jorgenson和Luckas，用石英毛细管进行电泳分析，柱效高达40万/米，促进电泳技术发生了根本变革，迅速发展成为可与GC、HPLC相媲美的崭新的分离分析技术——高效毛细管电泳。高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：一是采用了0.05mm内径的毛细管；二是采用了高达数千伏的电压。毛细管的采用使产生的热量能够较快散发，大大减小了温度效应，使电场电压可以很高。电压升高

8、，电场推动力大，又可进一步使柱径变小，柱长增加，高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱，理论塔板数高达几十万块/米，特殊柱子可以达到数百万。高效毛细管电泳的特点1.仪器简单、易自动化电源、毛细管、检测器、溶液瓶2.分析速度快、分离效率高在3.1min内分离36种无机及有机阴离子，4.1min内分离了24种阳离子；分离柱效：105～107/m理论塔板数；3.操作方便、消耗少