猪氟烷基因多样性检测.doc

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1、猪氟烷基因多样性检测hxc广东第二师范学院　　生物与食品工程学院　　　12生物科学摘要：从猪肌肉中提取DNA，用特异性引物进行PCR-AFLP扩增法对广州市赤岗市场所售10头猪的猪肉进行氟烷基因检测，以鉴定该市场猪肉肉质的好坏。结果表明，在所测定猪样本中，多为阴性纯合子（HaLNN）型，少数为杂合子（HaLNn）型，并没有出现肉质不好的阳性纯合子（HaLnn）型。关键词：氟烷基因　　PCR扩增　　凝胶电泳猪应激综合征（PSS）易导致猪应激而突然死亡或产生白肌肉，给养猪业造成巨大的经济损失。PSS是由于氟烷基因（Hal）或称骨骼肌兰尼定受体基因（RYR1

2、）突变所致，兰尼定受体基因CDS序列的C1843→T1843突变致使受体蛋白的第615位的氨基酸发生变异（Arg→Cys），引起蛋白结构和功能的改变；这种改变使猪在应激状态下肌肉组织中大量的Ca2＋异常释放，引起血浆β－内啡呔过量分泌，电解质代谢出现紊乱，发生肌肉持续收缩，进而使猪产生恶性高热；肌肉组织收缩需要大量能量，氧化分解供能不足，需要依靠糖酵解低，出现PSE肉。［1］内切酶HhaⅠ能识别野生型HalN基因的5’－GCG↓C－3’，即C1843位点，因此，可利用内切酶HhaⅠ检测C1843→T1843突变位点来判断猪的应激敏感性。1试验材料1.1

3、试验材料的采集购买广州市赤岗市场上10头猪的新鲜猪肉。1.2试剂 及仪器PCR反应相关试剂：含有镁离子的PCR缓冲液，特定的上下游引物，Taq DNA聚合酶，灭菌双蒸馏水。凝胶电泳相关试剂：琼脂糖，1×TAE或者1×TBE缓冲液等，上样缓冲液（Loading buffer），溴化乙锭（EB）。酶切相关试剂：HhaI限制性内切酶，酶切缓冲液等。冰箱、离心机、微量移液器、电泳槽、电泳仪、PCR仪、紫光灯、PCR扩增试剂盒等。2.试验方法2.1猪肌肉DNA的提取取200mg猪肉，置于1.5ml离心管中，剪碎，添加600μL裂解液和3μL蛋白酶K，55℃水浴过

4、夜消化。向离心管中加入Tris-饱和酚300μL，氯仿288μL，异戊醇12μL（25:24:1）室温振荡15min，1200r/min离心10min,溶液会呈现三层：上清、中间层和酚层。吸取上清液置于新的1.5mL离心管。加入700μL异丙醇，上下颠倒轻轻晃动，直至白色絮状DNA出现。以1200r/mim离心10min，弃上清，再加入75%乙醇700μL，轻轻晃动，将DNA晃动在溶液中漂浮。以1200r/min离心10min，弃上清液留下沉淀，室温干燥10min.向沉淀加入100μL双蒸水，放在4℃条件下溶解，备用。2.2琼脂糖凝胶电泳检测猪总DNA

5、质量2.2.1琼脂糖胶的制备称取0.6g琼脂糖、60mLTAE置于三角瓶中，煮沸，直至看不到固体。轻轻晃动，赶出气泡。待温度降至50℃—60℃，加入1μLEB染料。导入平板槽内，冷却固定后，拔出齿梳。2.2．2电泳将凝胶取出，放在水平电泳槽中，倒入1×TBE溶液，将凝胶完全浸没。取3 μLDNA提取物，并与7 μL100dingBuffer溶液混匀，将其点入梳孔中；同时在第一个一梳孔中加入Mark⁃er。接通电泳仪电源，150V电泳30min，最后关闭电源，紫光灯下进行观察或拍照。2.3PCR扩增猪氟烷基因2.3.1PCR反应体系的配制按照如下比例配制

6、，反应体积为20μL。各成分的用量如下（表1）：表1PCR反应体系（20μL）成分体积(μL)5×Buffer（含Mg2+）4×12=48dNTPs1.6×12=19.2TaqDNA聚合酶0.4×124.8上游引物0.4×12=4.8下游引物0.4×12=4.8ddH2O12.2×12=146.4将上述溶液置于1.5mL离心管中，然后各吸取19μL置于PCR小管中。然后，向每个PCR管中加入1μLDNA提取液。2.3.2PCR扩增将混合好的PCR溶液置于PCR仪中，反应条件为30个循环，预变性95℃、5min；进入循环94℃、30s,56℃、30s,7

7、2℃、30s；72℃延伸10min。2.3.3PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测取5μLPCR物，并与3μL100dingBuffer溶液混匀，将其点入梳孔中；同时在第一个一梳孔中加入Mark⁃er。1%琼脂糖凝胶电泳（150v）30min.紫外灯下进行观察或拍照。2.4AFLP检测猪氟烷基因多态性取PCR产物10μL，加入HhaI内切酶0.3μL和10×Buffer2μL，加超纯水至20μL，混匀。37℃恒温5min.全部产物用2%琼脂糖凝胶电泳（150v）30min，在紫光灯下观察并记录结果。3试验结果与分析3.1猪总DNA质量检测结果与分析如图1.猪D

8、NA样品经过染色、琼脂糖凝胶电泳后得到较亮的橘色条带，说明我们提取到了足量的猪基因组DNA并成