二基因工程的酶学基础ppt课件.ppt

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1、二基因工程的酶学基础生命科学学院生命科学学院第二章　基因工程的酶学基础第一节　限制性核酸内切酶第二节DNA连接酶第三节DNA聚合酶和反转录酶第四节DNA修饰酶第五节　外切核酸酶第六节　单链内切核酸酶第七节RNA酶生命科学学院本章重点掌握的内容限制性核酸内切酶、同裂酶、同尾酶、星星活性。II型限制性核酸内切酶命名原则、操作注意事项及产生星活性的原因、影响酶活性的因素。DNA聚合酶的种类及性质其它常用工具酶的功能及其用途。生命科学学院第一节限制性核酸内切酶任何一种生物体都存在防御外界物质进入的机制限制/修饰系统(R-M,R

2、estriction-modificationsystem)生命科学学院第一节限制性核酸内切酶大肠杆菌B大肠杆菌K修饰的phageλ(B)EOP=10-4（限制作用）EOP=10-4（限制作用）EOP=1（修饰作用）修饰的phageλ(K)人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍。即所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）。细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降解掉。一、寄主的限制与修饰现象EOP   Efficiency of plate成斑率生命科学学院第一

3、节限制性核酸内切酶生命科学学院第一节限制性核酸内切酶一、寄主的限制与修饰现象限制(restriction)：指一定类型的细菌可以通过限制酶的作用，破坏入侵的噬菌体DNA，导致噬菌体的寄主幅度受到限制。限制作用:实际就是限制性内切酶降解外源DNA，维护宿主遗传稳定的保护机制。生命科学学院第一节限制性核酸内切酶一、寄主的限制与修饰现象修饰(modification)：指寄主本身的DNA，由于在合成后通过甲基化酶的作用得以甲基化，使DNA得以修饰，从而免遭自身限制性酶的破坏。修饰作用:宿主细胞通过甲基化作用达到识别自身遗传物

4、质和外来遗传物质的目的。生命科学学院第一节限制性核酸内切酶一、寄主的限制与修饰现象1968Linn和Arber从E.coliB中发现限制酶Ⅰ1970Smith（美）在流感嗜血杆菌发现限制酶Ⅱ1978W.Arber，H.O.Smith，Nathans因发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献获得诺贝尔生物医学奖生命科学学院第一节限制性核酸内切酶一、寄主的限制与修饰现象寄主控制的限制与修饰的作用一是保护自身的DNA不受限制；二是破坏外源DNA使之迅速降解。基因工程中，应采用缺少限制作用的菌株作为受体。生命科学学院第一节限制

5、性核酸内切酶二、限制性内切酶的类型限制性核酸内切酶（限制性酶）：在细胞内能够识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列，并对DNA分子进行切割的一种酶。据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型。主要特性Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型限制修饰蛋白结构辅助因子识别序列切割位点双功能（具甲基化）异源三聚体ATPMg2+SAM距识别序列1kb处随机性切割单一功能同源二聚体Mg2+4-6bp回文序列识别序列内或附近特异切割双功能（具甲基化）异源二聚体ATPMg2+距识别序列下游24-26bp处随机性切割基因

6、工程中使用注：SAM为S－腺苷甲硫氨酸生命科学学院第一节限制性核酸内切酶1.I型限制性内切酶首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年从大肠杆菌B株和K株分离的。如EcoB和EcoK。（1）识别位点序列未甲基化修饰的特异序列。EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC生命科学学院第一节限制性核酸内切酶（2）切割位点在距离特异性识别位点约1000—1500bp处随机切开一条单链。（3）作用机理需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。Recognizesitecut1-1.5kb生命科

7、学学院第一节限制性核酸内切酶2.II类限制性内切酶首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。分离的第一个酶是HindⅡ（1）识别位点序列未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是回文序列），与DNA的来源无关。ABCC’B’A’A’B’C’CBAA’B’N’BAABNB’A’或生命科学学院第一节限制性核酸内切酶（2）切割位点识别位点处。切开双链DNA。形成粘性末端（stickyend）或平齐末端（bluntend）。如：EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG

8、-5’PstI5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’产生粘性末端EcoRV5’-GATATC-3’3’-CTATAG-5’产生平齐末端生命科学学院AAGCTTTTCGAAAAGCTTTTCGAAABCDDNADNAHindⅢHindⅢ切割位点核酸内切酶HindⅢ对双链DNA分子的切割作用生命科学学院第一节限制性核