第二章基因工程的酶学基础 (2).ppt

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1、第二章基因工程的酶学基础主要内容第一节限制性内切核酸酶第二节DNA连接酶第三节DNA聚合酶和反转录酶第四节DNA修饰酶第五节外切核酸酶第六节单链内切核酸酶第七节RNA酶补充：核酶甲基化酶第一节限制性内切核酸酶(RestrictionEndonuclease,RE)一、寄主的限制-修饰系统(R-M,Restriction-modificationsystem)大肠杆菌B大肠杆菌K修饰的phageλ(B)EOP=10-4（限制作用）EOP=10-4（限制作用）EOP=1（修饰作用）修饰的phageλ(K)注：EOP=噬菌体的成斑率第一节限制性内切核酸酶限制(restricti

2、on)：指一定类型的细菌可以通过限制性内切核酸酶（限制酶）的作用，破坏入侵的噬菌体DNA，导致噬菌体的寄主幅度受到限制。维护宿主遗传稳定的保护机制。第一节限制性内切核酸酶限制酶：在细胞内能够识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列，并对DNA分子进行切割的一种酶。1978年，W.Arber，H.O.Smith，Nathans因发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献获得诺贝尔生物医学奖。第一节限制性内切核酸酶修饰(modification)：指寄主本身的DNA，由于在合成后通过甲基化酶（甲基转移酶）的作用得以甲基化，使DNA得以修饰，从而免遭自身限制酶的破坏。第一节限制性内切

3、核酸酶第一节限制性内切核酸酶寄主控制的限制与修饰的作用：一是保护自身的DNA不受限制；二是破坏外源DNA使之迅速降解。基因工程中，应用采用缺少限制作用的菌株作为受体。例如K12：rk+mk+rk-mk-（用于转化实验）rk-mk+（用于转化实验）rk+mk-（自杀性表型）第一节限制性内切核酸酶根据限制性内切核酸酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型四类。二、限制性内切核酸酶的类型主要特性Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型限制修饰蛋白结构辅助因子识别序列切割位点多功能（具甲基化）异源三聚体ATPMg2+SAM距识别序列1kb处随机性切割单一功能同源三聚体Mg2+4

4、-6bp回文序列特异切割双功能（具甲基化）异源二聚体ATPMg2+距识别序列下游24-26bp处随机性切割基因工程中广泛使用注：SAM为S－腺苷甲硫氨酸REBASE数据库(http：//rebase.neb.com/)第一节限制性内切核酸酶1.用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名。大肠杆菌（Escherichiacoli）用Eco表示；流感嗜血菌（Haemophilusinfluenzae）用Hin表示。2.若该微生物有不同的变种或品系，再加上该变种或品系的第一个字母，如EcoRⅠ。3.如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制-修复系统，

5、用罗马字母表示，如EcoRⅠ，EcoRⅤ。4.限制酶前面要带上R（Restriction)，修饰酶前面要带上M（Modification）。(现已省略)三、限制性内切核酸酶的命名P14第一节限制性内切核酸酶若种名头2个字母相同则其中一个可用种名的第一和第三个字母。EcoRⅠEscherichia属名Coli种名Ry13株系编号第一节限制性内切核酸酶(一)识别序列的特异性识别顺序的碱基数一般为4-6bp，少数识别更长，多数识别位点具有旋转对称性（回文结构），少数的识别位点在切割位点之外，具旋转对称性。4bpHpaⅠC↓CGGGGC↑C5bpAvaⅡG↓GWCCCCWG↑G6

6、bpSmaⅠCCC↓GGGGGG↑CCC11bpBg1ⅠGCCNNNN↓NGGCCGGN↑NNNNCCGN=A,T,G,C四、Ⅱ型限制性内切核酸酶的基本特性第一节限制性内切核酸酶1.DNA分子酶切片段的末端Ⅱ型限制性内切核酸酶切割双链DNA，水解磷酸二酯键中3’位酯键产生两个末端，末端结构是5’-P和3’-OH，产生3种不同的切口。(二)切割位点的特异性第一节限制性内切核酸酶（1）5’突出的黏性末端第一节限制性内切核酸酶（2）3’突出的黏性末端第一节限制性内切核酸酶黏性末端：指DNA分子在限制性内切核酸酶的作用下形成的具有互补碱基的单链延伸形成的末端结构，它们能够通过互补

7、碱基间的配对而重新连接起来。P16nicknicks.nicknicks,第一节限制性内切核酸酶（3）平末端PstI5’-CTGCAG-3’5’-CTGCAOHPG-3’3’-GACGTC-5’3’-GPHOACGTC-5’EcoRI5’-GAATTC-3’5’-GOHPAATTC-3’3’-CTTAAG-5’3’-CTTAAPHOG-5’SmaI5’-CCCGGG-3’5’-CCCOHPGGG-3’3’-GGGCCC-5’3’-GGGPOHCCC-5’3’-黏性末端5’-黏性末端平末端第一节限制性内切核酸酶第一节限制性内切核