第二章基因工程的酶学基础

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1、幻灯片1第二章基因工程的酶学基础Enzymes幻灯片2第一节限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶（Restrictionendonuclease）是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4—8bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。幻灯片31.来源原核生物。2.性质内切酶。即在核酸分子链的内部制造切口的酶。3.功能自我保护作用。细菌的限制和修饰系统（R/M体系）幻灯片4（1）限制（Restriction）限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。幻灯片5（2）修饰（Modification）细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切

2、酶识别切割。①Dam甲基化酶GATC腺嘌呤N6位置引入甲基②Dcm甲基化酶CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上引入甲基幻灯片6幻灯片7二、限制性内切酶的类型目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶。I型限制性内切酶II类限制性内切酶III类限制性内切酶幻灯片81.I型限制性内切酶首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年从大肠杆菌B株和K株分离的。如EcoB和EcoK。（1）识别位点序列未甲基化修饰的特异序列。EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC幻灯片9（2）切割位点在距离特异性识别位点约1000—1500bp处随机切开一条单链。Reco

3、gnizesitecut1-1.5kb（3）作用机理需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。幻灯片102.II类限制性内切酶首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。分离的第一个酶是HindⅡ（1）识别位点序列未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是回文序列）。与DNA的来源无关。幻灯片11（2）切割位点识别位点处。切开双链DNA。形成粘性末端（stickyend）或平齐末端（bluntend）。如：EcoRI5’-GÜAATTC-3’3’-CTTAAÛG-5’PstI5’-CTGCAÜG-3’3’-GÛACGTC-5’产生粘性末端

4、EcoRV5’-GATÜATC-3’3’-CTAÛTAG-5’产生平齐末端幻灯片12（3）粘性末端（stickyends，cohensiveends）含有几个核苷酸单链的末端。分两种类型：①5’端凸出（如EcoRI切点）GÜAATTC5’--3’CTTAAÛG3’--5’5’-GAATTC-3’CTTAAG3’--5’幻灯片13②3’端凸出（如PstI切点）CTGCAÜG5’--3’GÛACGTC3’--5’5’--3’CTGCAG3’--5’GACGTC幻灯片14（4）粘性末端的意义①连接便利i）不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。这比连接两个平齐末端容易的多。ii）

5、同一个DNA分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。幻灯片15幻灯片16②5’末端标记凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。凸出的3’端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。③补平成平齐末端粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。幻灯片17（4）同裂酶（Isoschizomers)识别位点的序列相同的限制性内切酶。①完全同裂酶：识别位点和切点完全相同。如HindⅢ和HsuI。HindⅢ5’-AÜAGCTT-3’3’-TTCGAÛA-5’HsuI5’-AÜAGCTT-3’3’-TTCGAÛA-5’幻灯片18②不完

6、全同裂酶：识别位点相同，但切点不同。如XmaI和SmaI。XmaI5’-CÜCCGGG-3’3’-GGGCCÛC-5’SmaI5’-CCCÜGGG-3’3’-GGGÛCCC-5’幻灯片19（5）同尾酶(Isocaudamers）识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamHI、BglⅡ、BclI、XhoⅡ等BamHI5’-GÜGATCC-3’3’-CCTAGÛG-5’BglⅡ5’-AÜGATCT-3’3’-TCTAGÛA-5’BclI5’-TÜGATCA-3’3’-ACTAGÛT-5’5’-UÜGATCY-3’3’-YCTAGÛU-5’XhoⅡU代表嘌呤；Y代表嘧啶。幻灯片20S

7、au3A5’-ÜGATC----3’3’----CTAGÛ-5’同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。？GATCT-3’A-5’5’-G3’-CCTAGBamHIBglⅡ5’-GGATCT-3’3’-CCTAGA-5’BglⅡBamHISau3A幻灯片21（6）限制酶的酶活性限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、pH等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。所以一般使用专一的反应缓冲液。①星号（*）活性如果改变反