烟草抗PVYN突变株SN01的SRAP—PCR反应体系的建立与优化-论文.pdf

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1、2013—12，34(6)中国烟草科学ChineseTobaccoScience烟草抗PVYN突变株SN01的SRAP—PCR反应体系的建立与优化李杰，朱丹，李颖，安梦楠，赵秀香，吴元华(1．沈阳农业大学植物保护学院，沈阳110866；2．辽宁省抚顺市农业技术推广中心，辽宁抚顺113006)摘要：采用正交试验对烟草抗PvY突变株SN01幼嫩叶片的SRAP．PeR反应体系中5个主要因素(dNTPs、Mg2+TaqDNA聚合酶、引物和DNA)进行了优化以建立合适的SRAP反应体系。结果表明，在20的反应体系中，各因素的最佳加入量分别是：dNTPs(2．5mmol／L)3．2、Mg(25m

2、mol／L)1．6、TaqDNA聚合酶(2．5U／)O．16、引物(10~maol／L)0．6uL、DNA模板120ng。对该SRAP．PeR反应程序中的退火温度和循环次数筛选表明，最佳退火温度为57℃，循环次数为35次。该优化体系的建立，为进一步对烟草抗PvY突变株SN01的抗病基因研究提供了可靠基础。关键词：烟草；抗pVyN突变株；SRAP．PCR；体系优化中图分类号：$572．08文章编号：1007．5119(2013)06．0093-05DOI：10．39694．issn．1007—5119．2013．06．018OptimizationforSRAP—PCRSystemof

3、TobaccoMutantSN01withResistanttoPVYNLIJie，ZHUDan，LIYing，ANMengnan，ZHAOXiuxiang，WUYuanhua(1．ShenyangAgriculturalUniversity,Shenyang110866，China；2．FushunAgriculturalTechnologyExtensionCenterofLiaoningProvince，Fushun，Liaoning113006，China)Abstract：InordertoestablishasuitableSRAPreactionsystem，theor

4、thogonalexperimentwasusedtoestablishandoptimizethefivemainfactors(dNTPs，Mg，TaqDNApolymerase，primer,andDNAtemplate)ofsequence-relatedamplifiedpolymorphism(SRAP)systemwithyoungleavesoftobaccomutantSN01resistanttoPotatovirusy-veinnecrosisstrain(PVY)．Theresultsshowedthatthebestamountsoffactorsin20o

5、fthereactionsystemwere：dNTPs(2．5mmol／L)3．2，Mg(25mmol／L)1．6，TaqDNApolymerase(2．5U／)0．16p．L，primer(10~tmol／L)0．6L，DNAtemplate120ng，respectively．Thebestannealingtemperatureof57℃andcycletimesfor35oftheSRAPprogramwerealsoconducted．Thisoptimizedsystemprovidesreliablebasisforfurtherstudyontheresistanc

6、egenesoftobaccoresistancemutantSN01．Keywords：tobacco；mutantwithresistanttoPVY：sequence—relatedamplifiedpolymorphism；systemoptimizingSequence—relatedamplifiedpolymorphism(S)NC89中筛选获得了高抗马铃薯Y病毒脉坏死株系标记技术是一种新型的基于PCR的显性标记系统(PotatovirusY-veinnecrosisstrain，PVY)的植株[1】，该技术利用独特的双引物对基因的openreading(暂定名为SN0

7、1)，并对该突变株的抗病生理生化frames(ORFs)特定区域进行扩增，与RAPD、SSR、机制进行了报道[9]。采用正交试验建立优化的AFLP等技术相比，SRAP技术具有操作简便、重SRAP．PCR反应体系，为进一步研究其抗病基因奠复性好、信息丰富等优点，特别是对序列信息未知定基础。的物种研究提供了快捷简便的途径。该技术已成功1材料与方法用于一些重要性状的标记、基因定位、遗传图谱的构建和抗病基因相关方面研究【2J。1．1材料本研究室通过人工接种的方法从