稻瘟病菌一假定几丁质酶多克隆抗体的制备及其检测-论文.pdf

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1、植物病理学报ACTAPHYTOPATHOLOGICASINICA44(3)：247-253(2014)稻瘟病菌一假定几丁质酶多克隆抗体的制备及其检测吴丽民一，连永乐，王宗华，汪世华，鲁国东(。福建生物工程职业技术学院，福州350002；福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室，福州350002)摘要：为检测几丁质酶的表达，制备稻瘟病菌的一假定几丁质酶多克隆抗体，探索其可能运用。将稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)几丁质酶基因克隆入融合表达载体pET-32a，并在大肠杆菌EscherichiacoliBL

2、21(DE3)中进行诱导表达。表达菌株经0．5mmol／LIPTG诱导4—6h后，用Ni2+_NTA亲和柱纯化蛋白，得到可溶的几丁质~g-His融合蛋白。以该融合蛋白免疫新西兰雄兔，制备多克隆抗体。ELISA分析表明该抗体效价达l：2O48O0，特异性良好。用该抗体ELISA检测了稻瘟病菌4个不同田间菌株中，不同的菌株表达量不同。对稻瘟病菌侵染水稻3、5和7d后的病叶进行抗原Western验证，结果表明，稻瘟病菌不同的侵染时间其几丁质酶表达量有明显差异。几丁质酶表达的差异是否与菌株间致病型等生物学和生理学差异有关，目前正在

3、进一步研究。关键词：稻瘟病菌；几丁质酶；多克隆抗体；ELISAPreparationofpolyclonalantibodyofachitinasefr0mMagnaportheoryzaeanditsusagefordetectionWULi．min一，LIANyong—le。，WANGZong—hua。，WANGShi—hua，LUGuo—dong(FujianEngineeringBiotechnologyCollege，Fuzhou，350002，China；KeyLaboratoryofBio—pesticide

4、andChemistryBiology，MinistryEducation；FujianAgricultureandForestryUniversity，Fuzhou，350002，China)Abstract：ThechitinasegeneofMagnaportheoryzaewasclonedintothefusionexpressionvectorpET-32aandexpressedinEscherichiacoliBL2I(DE3)hostcells．Aftertheexpressionstrainwasind

5、ucedfor4-6hoursby0．5mmoLIPTG，solublechitinasewereobtainedfromupperliquidandpurifedbyNi一NTAaffinitychromatographycolumn．ThisfusionproteinwasinjectedintoNewZealandrabbitstogetpolyclonalantibody．ELISAanalysisshowedthatthetiterofthispolyclonalantibodywithgoodspecifici

6、tywas1：204800．Culturefiltratesof4MagnaportheoryzaewildtypestrainsweretestedwiththisantibodybyELISAandvivochitinasedetectionduringthepathogeninfectionwascarriedbyWesternblot．Theresultshowedthattheexpressionlevelofthechitinaseappearedtobesignificantlydifferentamongd

7、ifferentstrainsaswellasdifferentinfectionstagesofthestrain70—15．Whethertheexpressionlevelofthechitinaseisrelatedtothebio-logicalandphysiologicalcharacteristicssuchaspathogenicityamongdifferentstrainsstillremainsfurtherstudy．Keywords：Magnaportheoryzae；chitinase；ant

8、ibodypreparation；ELISA中图分类号：Q939．91文献标识码：B文章编号：0412—0914(2014)03·0247—07稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)引发的稻瘟病1000多个，分泌蛋白可能起激发子和致病因子是水稻最重要的病害之一，同时，该菌也是研究丝的作用J。状真