细胞外信号调节激酶通路在乙肝病毒X基因改变肝癌细胞化疗敏感性中的作用.pdf

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1、·2064·中华实验外科杂志2013年1O月第3O卷第10期ChinjExpSurg，October2013，Vo1．30No．10，·月干脏夕卜科·细胞外信号调节激酶通路在乙肝病毒X基因改变肝癌细胞化疗敏感性中的作用姜迎海李玉龙张磊夏令杰王静【摘要】目的观察细胞外信号调节激酶(ERK)信号传导通路在乙肝病毒x基因(HBx)改变肝癌细胞HepG2对顺铂敏感性中的作用。方法采用聚合酶链反应(PCR)法从pCP10质粒中扩增482bpHBx的开放读码框(ORF)，构建表达载体pcDNA3一HBx并进行酶切及测序鉴定。应用脂质体将其转染HepG2，50mg／LG418筛选

2、阳性克隆，抽提mRNA，逆转录(RT)．PCR鉴定是否稳定表达HBx。Westernblot法检测转染前后44x10及42×10磷酸化ERK1／2(p-ERK1／2)的表达。噻唑蓝(M盯)法检测转染空脂质体组、空载体组HepG2、HBxHepG2对2mg／L顺铂敏感性的差异，以及顺铂联合ERK通路特异性抑制剂PD98059对HBxHepG2抑制率的改变。结果从pCP10中扩增得到482bpHBx—ORF片段。将其与pcDNA3连接后经酶切及测序鉴定，成功构建HBx—ORF表达载体。从(；418抗性细胞充隆巾成功扩增出482bpHBx—ORF，表明转染后的HepG2细

3、胞稳定表达目的片段。经Westernhlot及灰度扫描鉴定，HBx细胞中p-ERK蛋门表达是空脂质体组的1．97倍，是空载体组的1．67倍。M_rr法检测2mg／L顺铂作用24h，对HBxHepG2的抑制率为19．56％，明显低于对空脂质体组和空载体组HepG2的抑制率(35．21％和30．18％)。而先以100mol／LPD98059孵育2h的HBxHepG2，顺铂对其抑制率上升至31．20％，与未加PD98059时比较有显著提高(P<0．05)。结论ERK信号传导通路的激活在抑制HBx的肝癌细胞的化疗敏感性方面起重要作用，对该通路的特异性抑制有助于提高HBx肝癌

4、的化疗效果。【关键词】乙肝病毒x基凶；细胞外信号调节激酶；癌，肝细胞；顺铂Theroleofextracellularsignal-regulatedkinasecascadesinthesensitivityalterationtocisplatinofHepG2expressinghepatitisBvirusXgeneJIANGYing—Hai，L1Yu—，ZHANGLei，XIALing—fie，，vGring．DepartmentofPainManagement，HenanProvincialPeople’sHospital，Zhengzhou450003

5、，ChinaCorrespondingauthor：zHANGLet．Email：zhangleil414@163．corn【Abstract】Objectiveroinvestigatetheroleofextracellularsignal—regulatedkinase(ERK)cas—cadesinthesensitivityaherationtocisplatin(CDDP)ofHepG2expressinghepatitisBvirusXgene(HBx)．MethodsThe482_bpopenreadingframe(0RF)ofHBxwasclon

6、edfromtheplasmidpCP10．ConstructHBx—ORFintotheexpressionvectorpCDNA3andcheckwhetheritissuccessfulbysequencingandenzymecutting．TransfectHepG2withthevetorpCDNA3HBxbyliposomeandselect(l850mg／LresisitantHepG2clonestoidentifvtheexistenceofHBx0RFwithreversetranscription—polymerasechainreactio

7、nfRT—PCR)．Comparetheexpressionof44x10and42×10p．ERKI／2proteinintheHBx一0RFpositiveandnegativechinesbyWesternblotting．Comparethedifferencesofsensitivityto2mg／LCDDPa—mongHBx一0RFpositiveHepG2．1iposometransfectedHepG2andmockvetortransfectedHepG2andchan—gesofsensitivitytoCDDPwithandwithoutt