re-poqgm高效液相色谱法课件.ppt

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1、第十五章高效液相色谱法(Highperformanceliquidchromatography,HPLC)以液体为流动相的色谱分析方法称为液相色谱法（LiquidChromatography，LC）。液相色谱主要包括柱色谱和平板色谱（纸色谱和薄层色谱）等。高效液相色谱法是以气相色谱为基础，在经典液相色谱实验和技术基础上，采用颗粒十分细的固定相，并采用高压泵输送流动相而建立的一种液相色谱法。HPLC与经典LC区别经典液相色谱高效液相色谱常压或减压填料颗粒大柱效低分析速度慢色谱柱只用一次不能在线检测高压，40～50Mpa填料颗粒小，2～50μm柱效高，40000～600

2、00块/m分析速度快色谱柱可重复多次使用能在线检测HPLC与GC差别气相色谱高效液相色谱只能分析挥发性物质，只能分析20%的化合物不能用于热不稳定物质的分析用毛细管色谱可得到很高的柱效有很灵敏的检测器如ECD和较灵敏的通用检测器（FID和TCD）流动相为气体、无毒、易于处理运行和操作容易仪器制造难度较小几乎可以分析各种物质可以用于热不稳定物质的分析色谱柱不能很长，柱效不会很高没有较高灵敏的通用检测器流动相有毒、费用较高运行和操作比GC难一些仪器制造难度大流动相差别GC：流动相为惰性气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用HPLC：流动相为液体流动相与组分间有亲合作

3、用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素流动相种类较多，选择余地广流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相可以增大分离选择性操作条件差别GC：加温操作HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）第一节液相色谱柱效速率理论（与GC对比）1.2.2）涡流扩散项及其影响讨论：1）流动相流速对HPLC板高的影响3）传质阻力项及其影响第二节高效液相色谱仪高压输液系统、进样系统、分离系统和检测系统。此外还配有辅助装置：如梯度淋洗，自动进样及数据处理等。当注入欲分离的样品时，高压泵将贮液器中流动相经过进样器，将样品带入色谱柱进行分离

4、，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，得到液相色谱图。1．高压输液系统固定相颗粒极细，对流动相阻力很大，配备有高压输液系统。一般由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成。（1）流量稳定、无脉动，流量精度和重复性在1~2%左右；（2）流量范围宽，且连续可调，一般在0.01~10mLmin-1之间，制备型仪器能达到100mLmin-1；（3）输出压力高、密封性好，要求最高压力300~500kg/cm2；（4）耐腐蚀，能适用于各种有机溶剂、水和缓冲溶液；（5）操作、更换溶剂方便，易于清洗和维修，容易实现梯度淋洗和流量程序控制等。2．进样系统

5、高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约5～30cm），柱外展宽（又称柱外效应）较突出。柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。柱外展宽可分柱前和柱后展宽。进样系统是引起往前展宽的主要因素。3、分离系统——色谱柱色谱柱包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。一般色谱柱长5～30cm，内径为4～5mm，凝胶色谱柱内径3～12mm，制备往内径较大，可达25mm以上。柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填料（＜20μm）一般采用匀浆填充法装柱，

6、先将填料调成匀浆，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。4．检测系统（1）溶质性检测器仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，属于这类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等。光电二极管阵列检测器（2）总体检测器对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，属于这类检测器的有示差折光，电导检测器等。5、附属系统包括脱气、梯度淋洗、恒温、自动进样、馏分收集以及数据处理等装置。其中梯度淋洗装置是高压液相色谱仪中尤为重要的附属装置。梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强度、极性、pH值

7、或离子强度相应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。梯度洗脱的实质是通过不断地变化流动相的强度，来调整混合样品中各组分的k值，使所有谱带都以最佳平均k值通过色谱柱。它在液相色谱中所起的作用相当于气相色谱中的程序升温，所不同的是，在梯度洗脱中溶质k值的变化是通过溶质的极性、pH值和离子强度来实现的，而不是借改变温度（温度程序）来达到。梯度淋洗装置外梯度:利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。内梯度:一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。第三节分配色谱