《高效液相色谱法A》PPT课件

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1、第三章高效液相色谱法第一节高效液相色谱法的特点以气相色谱为基础，在经典液相色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法引入气相色谱法的理论，在技术上采用新型高效的固定相、高压输液泵、梯度洗脱技术以及各种高灵敏度的检测器，实现了分析速度快、分离效率高和操作自动化一、经典液相柱色谱法与高效液相色谱法的比较经典液相色谱高效液相色谱常压或减压高压，40~50MPa填料颗粒大，75～600μm填料颗粒小，2～50μm柱效低，2～50块/m柱效高,40000~60000块/m分析速度慢，1～20小时分析速度快，0.05～1.0h色谱柱

2、只用一次色谱柱可重复多次使用不能在线检测能在线检测二、气相色谱法与高效液相色谱法的比较相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测主要差别：分析对象的差别、流动相的差别、操作条件差别分析对象的差异GC能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品不可检测占有机物的20%HPLC溶解后能制成溶液的样品不受样品挥发性和热稳定性的限制分子量大、难气化、热稳定性差及高分子和离子型样品均可检测用途广泛，占有机物的80%流动相差别GC：流动相为惰性气体组分与流动相无亲合作用力只与固

3、定相作用流动相差别（续）HPLC：流动相为液体流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用流动相种类较多，选择余地广流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相可以增大分离选择性操作条件差别GC：加温操作HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）三、高效液相色谱法的特点（1）高压：供液压力和进样压力可达5×104kPa（2）高速:流动相流速加快（3）高效:柱效可达3万塔板/米以上。（4）高灵敏度:10-16～10-9克（5）选择性高

4、：可以通过流动相的控制来改善分离过程的选择性（6）应用范围广四、影响色谱峰扩展及色谱分离的因素热力学理论：塔板理论——平衡理论基础动力学理论：速率理论——Vander方程（一）塔板理论（二）速率理论HPLCH=He+Hd+Hs+Hmm+Hsm固定相传质阻力流动流动相传质阻力滞留流动相传质阻力涡流扩散分子扩散1、涡流扩散项HeHe＝A=2λdp2、分子扩散项Hd样品在色谱柱中滞留的时间愈长，色谱谱带的分子扩散也愈严重。Dm≈10-5cm2/s（比在气体中要小4—5个数量级），所以在液相色谱中，纵向分子扩散项实际上可以忽略

5、3、传质阻力项(1)固定相传质阻力项Hs：(2)流动相传质阻力项：①流动的流动相的传质阻力Hmm②滞留的流动相的传质阻力HsmVanDeemter方程分子扩散和传质阻力对板高的贡献固定相粒度大小对板高的影响（三）影响谱带展宽的其他因素柱外效应第二节高效液相色谱仪液相色谱的基本流程图流动相泵色谱柱检测器泵输液分离检测记录AEGBCDF进样阀进样一、贮液和脱气装置1储液罐材质：玻璃、不锈钢、氟塑料或特种塑料聚醚酮（PEEK）容积：0.5~2.0L放置位置：高于泵体，保持一定的输静压差注意：密封、过滤2、流动相----过

6、滤、脱气流动相过滤的目的过滤去除可能存在的微小固体颗粒，保护色谱高压泵和色谱柱流动相过滤方法在线过滤抽真空过滤过滤用膜：水系和有机孔径：0.22µm和0.45µm流动相脱气的目的使色谱泵的输液准确输液均匀准确，并且脉动减小保留时间及色谱峰面积的重现性提高提高检测的性能防止气泡引起的尖峰基线稳定，信噪比增加溶剂的紫外吸收本底降低保护色谱柱减少死体积防止填料的氧化常用的脱气方法有：①吹氦脱气法：原理：利用氦气在液体中的溶解度比空气低。特点：效果好，适合所有溶剂，但成本高，使用较少②加热回流法：脱气效果也比较好③抽真空脱气法：特

7、点：可以一次完成过滤和脱气任务注意：抽真空会引起混合溶剂组分的变化，适合单一溶剂体系④超声波脱气法简单，但效果不理想常用的脱气方法（续）⑤在线真空脱气法把真空脱气装置串接到储液系统，结合膜过滤器可以实现流动相的连续在线真空脱气。二、高压输液系统高压输液泵性能：①泵体材料耐化学腐蚀②能在高压下连续工作③输液流量范围宽④输出流量稳定、重复性高：流量控制的精密度应小于1%（最好为0.5%），重复性最好为0.5%高压输液泵分类：恒压泵和恒流泵1、恒流泵输出恒定体积流量的流动相注射型恒流泵往复型双柱塞往复式并联泵双柱塞往复式串联泵往

8、复型泵目前使用的是双柱塞往复式并联泵和双柱塞往复式串联泵往复型泵优点：☺可以在高压下连续以恒定的流量输液☺液缸容积很小，柱塞容易密封，造价低☺更换溶剂方便，特别适用于梯度洗脱往复型泵缺点：流动相存在脉动，难以用折光示差检测器进行定量分析柱塞式往复泵、柱塞和流动相直接接触，易造成污染长期运转后，流动