高效液相色谱法课件.ppt

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1、第一节液相色谱仪器（highperformanceliquidchromatograph）液相色谱仪（1）液相色谱仪（2）液相色谱仪（3）液相色谱仪（4）Agilent1100系列高效液相色谱系统二、高效液相色谱法的特点（featureofHPLC）特点：高压、高效、高速、高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。高效液相色谱法与经典液相色谱法经典液相柱色谱装置高效液相色谱仪例：分离20种氨基酸柱长：170cm柱径：0.9cmF：30mL/ht分离:>20h经典柱色谱HPLCt分离：1h慢中等快色谱分离Temporalco

2、urse淋洗液液相色谱以液体为流动相，固定相可以是固体或液体（担载在固体表面），与气相色谱比，带来一系列变化：例如，填充柱气相色谱柱，一般填料的尺寸为80-100目，粒度大约是2毫米，而一般高效液相色谱的固定相粒度在2－10微米，因此流动相通过这样一段固定床时就产生了很高的反压。由于液体与气体性质的以下差异：溶质在液体中的扩散系数比它在气体中小105倍左右液体粘度比气体约大102倍液体表面张力比气体大104倍左右液体密度比气体约大103倍液体不可压缩因此，我们通常所说的高效液相色谱，实际也是高压液相色谱，因为没有很高的压力就不可能产

3、生很高的分离效率。三、流程及主要部件（processandmainassemblyofHPLC）1.流程（动画）2.主要部件(1)高压输液泵主要部件之一，压力：150～350×105Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性。(2)梯度淋洗装置外梯度:利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。内梯度:一台高压泵,通过比例调节阀，将两种或多种不同

4、极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。(3)进样装置流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：(4)高效分离柱柱体为直型不锈钢管，内径1～6mm，柱长5～40cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。(5)液相色谱检测器a.紫外检测器应用最广，对大部分有机化合物有响应。特点：灵敏度高；线形范围高；流通池可做的很小（1mm×10mm，容积8μL）；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。一些常用溶剂的紫外截止波长b.光电二极管阵列检测器紫外检测器的重要进展；光电二极管阵列

5、检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。光电二极管阵列检测器c.示差折光检测器（differentialrefractiveindexdetector）除紫外检测器之外应用最多的检测器；可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比；通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）；灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱；偏转式、反射式和干涉型三种。示差折光检测器d.荧光检测器（fluorescencedetector）高灵敏度、高选择性；对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素

6、、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应。§17-2基本理论一色谱柱柱效的基本关系式二分离度三速率方程溶质在液相流动相中的扩散系数，约为气相中扩散系数的万分之一流动相流速对板高的影响1)小颗粒填料，填充均匀；2)选择较低的流动相流速；3)选择粘度小的溶剂作流动相，改善传质。修正的速率方程：提高柱效途径硅胶－强极性氧化铝－弱极性活性炭－非极性分子筛－强极性高分子多孔微球(GDX)固体吸附剂§17-3高效液相色谱分离方法一(液-固)吸附色谱法1.吸附剂一般为多孔性的物质，在它们的表面存在着分散的吸附中心，溶质分子和流动相分

7、子在吸附剂表面的活性中心上进行竞争，同时不同溶质之间和同一溶质的不同官能团之间也存在竞争。竞争的综合结果就是形成不同溶质在吸附剂表面吸附、解吸平衡。2分离原理Kad值越大，保留时间越长。可表式为：吸附色谱的分离机理随着样品在固定相上的吸附能力由大到小在色谱柱上的保留由长到短硅胶表面结构硅胶表面结构经热处理发生的变化缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾。极性吸附剂上有机化合物的保留顺序如下：氟碳化合物<饱和烃<烯烃<芳烃<有机卤化物<醚<硝基化合物<腈<叔胺<酯醛酮<醇<伯胺<酰胺<羧酸<磺酸3流动相(洗脱剂)越大，表明流动相溶剂分子对

8、吸附剂的亲和能力越强，则越易从吸附剂上将被吸附的溶质洗脱下来。溶剂分子在单位吸附剂表面上的吸附自由能溶剂强度参数各种不同极性的一元或多元溶剂。硅胶固定相分离苯，甲苯，乙苯，丙苯，丁苯流动相：干燥正庚烷1份水饱和的正庚烷2份干燥正庚烷水